ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａｎｇｈａｉ

ＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ）

文章编号：０２５８—５８９８（２００９）０２—０２３６一０５

技术与方法

酵母双杂交报告基因１３一半乳糖苷酶活性测定方法的研究

郜

尽１，

王海侠２。

李京敬１。俞雁１

（１．上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室，上海２００２４０；２．安徽科技学院理学院，凤阳２３３１００）摘

要：目的建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的Ｂ一半乳糖苷酶活性测定方法。方ｉｉ采用０一硝基一Ｂ—Ｄ一半乳

糖苷（ＯＮＰＧ）为底物，以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁，通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对Ｂ一半乳糖苷酶酶活的影响，确定最佳酶活测定条件。结景相同条件下，单个克隆之间的酶活有差异，相对标准偏差（ＲＳＤ）＞

８％；相同条件下，Ｙ】８７酵母株比ＡＨｌ０９酵母株酶活高１８—２０倍，并且本底水平很低甚至没有；双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间，同预计一致；质粒顺序转化与共转化在ＡＨｌ０９中差异有统计学意义（Ｐ＜０．００１），而在Ｙ１８７中没有明显差异

（Ｐ＞０．０５）。结论测定酵母双杂交报告基因Ｂ一半乳糖苷酶的活性宜采用Ｙ１８７酵母株，酶活变化范围大，本底小，受转化方法

影响小，测定时选取５个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定。

关键词：酵母双杂交；中图分类号：Ｑ５５

８一半乳糖苷酶；

文献标志码：Ｂ

蛋白互作；

酶活测定

酵母双杂交技术是１９８９年由美国科学家Ｆｉｅｌｄｓ等…人提出的，由于操作简便，该技术一出现便迅速得到广泛应用。经过近２０年的不断完善和发展，已经衍生出酵母单杂交旧１、酵母三杂交ｏ和酵母反杂交。等多种技术，并且已经实现高通量和自动化。作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的最成熟的技术平台，酵母双杂交技术是后基因组时代最常用的方法之一。现在，利用

该技术已经把人‘５。引、果蝇‘７｜、线虫‘８３和酵母‘９３等模式动物的蛋白质组水平的互作图谱绘制完成。

Ｙ１８７分别属于ａ型和ｏ【型单倍体酵母株，并带有多种氨基酸等营养缺陷标记，可分别用于作为“猎物”ＡＤ融合蛋白和作为“诱饵”的ＢＤ融合蛋白的宿主。然后，通过相互作用的蛋白“拉”近ＧＡｌＡ的两个结构域，使其恢复转录活性，启动下游报告的表达。

由于ｄ一半乳糖苷酶在ＡＨｌ０９中是分泌表达，而Ｂ一半乳糖苷酶只能表达在酵母细胞内，所以相对于ｄ一半乳糖苷酶的检测，Ｂ一半乳糖苷酶的检测更为复杂。本文通过对酵母双杂交系统中诱导的Ｂ一半乳糖苷酶活性测定方法多种影响因素的系统考察，拟将Ｂ一半乳糖苷酶这一报告基因的酶活测定方法标准化，为相关研究人员提供参考。１材料与方法

１．１

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，其原理巧妙利用了酵母反式转录激活因子的组件式结构。以酵母转录因子ＧＡｌＡ为例，结构上可以分为功能上相互独立的结构域，ＤＮＡ结合结构域

（ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ＢＤ）和转录激活结构域（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ

材料采用基于ＧＡｌＡ的酵母双杂交系统３

ｄｏｍａｉｎ，ＡＤ）。这两个结构域分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两个结构域通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的ＧＡＬ４转录因子活性，并可结合到上游激活序

列（ｕｐｓｔｒｅａｍ

ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ

（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）为操作平台，包括ＡＤ、ＢＤ空载体，构建完

毕的ＳＶ４０Ｔ抗原和激活结构域融合蛋白质粒ＡＤ－Ｔ，以及与之配对用于阳性对照的ＢＤ．５３（Ｍｕｒｉｎｅｐ５３）和用于阴性对照的ＢＤ—Ｌａｍ（ＨｕｍａｎｌａｍｉｎＣ）。野生

ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＵＡＳ），激活下游的

型ＧＡｌＡ为构建到ＡＤ质粒上的全长的酵母转录因子，包含天然的激活结构域和ＤＮＡ结合结构域、基础

氮源培养基和全营养培养基（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；各种氨基酸以及ＰＥＧ３３５０、醋酸锂、二甲亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）、Ｏ一硝基一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ｏ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌＢ－Ｄｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＯＮＰＧ）和Ｘ－ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ）；Ｈｅｒｒｉｎｇ

ＴｅｓｔｅｓＣａｒｒｉｅｒＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；琼脂糖（Ｂｉｏｗｅｓｔ）；质

启动子，使启动子下游报告基因得以转录。

酵母菌的生活史属于双单性类型，它们的单倍体细胞和二倍体细胞都能进行无限制的分裂。一般单倍体有ａ和ｄ两种接合型，不同接合型的单倍体酵母株细胞接合生成二倍体细胞０｜。基于ＧＡＬ４的酵母双杂交系统３采用的两个酵母株ＡＨｌ０９和

基金项目：国家高技术研究发展计划（。８６３”计划）（２００７ＡＡ０２２１４９）；安徽省优秀入才基金项目（２００６ＪＱｌｔ９６）。作者简介：郜尽（１９７６一）。男．博士生；电子信箱：ｇ．．ｊｉｎ＠Ｂｊｔｕｅｄｕ．ｃｎ。通讯作者：俞雁．电子信箱：ｙａｎｙｕ＠ａｊｔａ．ｅｄｕ．ｃａ。

万方数据

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