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| 试剂、试剂盒 | 提取液洗涤液溶解液第一向电泳缓冲液还原溶液烷基化溶液琼脂糖溶液丙烯酰胺凝胶溶液 仪器、耗材 | 双向凝胶电泳光扫描仪或密度计
实验步骤 | 3.1可溶性总蛋白的提取方法（三氯乙酸/丙酮法） (1)从拟南芥细胞悬浮培养液中收集细胞。 (2)液氮中研磨细胞。 (3)向研磨好的细胞粉末中加入提取液，在-20℃放置至少30min(见注释7)。 (4)42000g离心以除去不溶物，用洗涤液（见注释8)清洗3次（见注释8)。 (5)将管子放置在空气中使其干燥。 (6)在溶解液中振荡沉淀2h溶解蛋白（见注释9)。 (7)根据Bradford法[3，4]测定蛋白浓度，使用等份样品和血清白蛋白作标准曲线(等份样品是指相同比例的溶液）。 3.2双向凝胶电泳 (1)直接用第一向电泳溶液相匹配的100μg蛋白质溶液水化IPG胶条（18cm，pH4.0~7.0)。 (2)进行等电聚焦直至100kV/h。 (3)进行第二向电泳前，在还原液中将蛋白质还原后再用烷化液将蛋白质进行烷基化处理，两者各15min。 (4)将胶条用琼脂糖溶液包埋在11%的丙烯酰胺胶的顶端。 (5)在电泳缓冲液中进行SDS-PAGE，每块胶15mA，10°C过夜（见注释10)。 3.3CCB染色和成像（见注释11、注释12) 根据Neuhoff等的方法对凝胶进行染色。每一步操作中，每块胶使用300ml溶液。所有操作均需振荡。 (1)将凝胶浸没在固定液中至少2h或者过夜以固定蛋白。 (2)用水清洗凝胶三次，共30min。 (3)将凝胶转移到培育液中培育1h (见注释13)，然后再转移到染色液中（见注释13、注释14)。 (4)轻微振荡，在染色液中显影5天。 (5)用水清洗凝胶，用扫描仪在300dpi分辨率下获取图像（图14-1)。  3.4SN染色和成像（见注释11、注释12) 根据Mortz等[15]的方法对凝胶进行染色。每一步操作中，每块胶使用300ml溶液。所有操作均需振荡。 (1)将凝胶浸没在固定液中至少2min或者过夜以固定蛋白质。 (2)用洗涤液清洗凝胶3次共20min。 (3)在敏化液中短时间浸泡凝胶（2min)(见注释15)。 (4)用水清洗凝胶3次，5min。 (5)在染色液中浸染凝胶20min。 (6)用水快速清洗凝胶2次共1min。 (7)将凝胶放入显色液中5~10min (见注释16)。 (8)在终止液中终止显色5min后将凝胶转移到贮存液中。 (9)使用扫描仪在300dpi分辨率下获得图像（图14-1)。 3.5SR染色和成像（见注释11、注释12和注释17) 每一步操作中，每块胶使用300ml溶液。所有操作均需振荡。 (1)将凝胶浸没在固定液中30min以固定蛋白。 (2)凝胶在染色液中侵染至少30min(最多1h)。 (3)用洗涤液清洗凝胶30min。 (4)使用带473nm激光激发和长通道滤光镜Y510的FLA-5000分析仪获取图像。选择条件为100μm分辨率、16位灰度、光电管电压700V(图14-2)。  3.6DP染色和成像（见注释11、注释12和注释17) 每一步操作中，每块胶使用300ml溶液。所有操作均需振荡。 (1)将凝胶浸没在固定液中1h以固定蛋白。 (2)用水清洗凝胶4次，每次10min。 (3)凝胶在染色液中浸染1h。 (4)用洗涤液1清洗凝胶2次、10min，然后再用洗涤液2清洗2次，10min。 (5)使用带532nm激光激发和长通道滤光镜0575的FLA-5000分析仪获取图像。选择条件为100μm分辨率、16位灰度、光电管电压700V(图14-2)。 3.7C16-F染色和成像（见注释10、注释11、注释17和注释18) 根据Kang等[27]的方法对凝胶进行染色。每一步操作中，每块胶使用300ml溶液。所有操作均需振荡。 (1)将凝胶浸没在固定液和染色液中对蛋白同时进行固定和染色。 (2)用洗涤液至少清洗凝胶2次，每次5min。 (3)使用带473nm激光激发和长通道滤光镜Y510的FLA-5000分析仪获取图像，选择条件为100μm分辨率、16位灰度、光电管电压700V (图14-2)。 3.8染料间的比较 以上染色方法中，当上样为100μg拟南芥组培细胞中提取的总可溶性蛋白时，CCB通常可检出250个蛋白质点，C16-F可检出450个蛋白质点、DP可检出550个蛋白质点、SN可检出600个蛋白质点、SR可检出800个蛋白质点（图14-1和图14-2)。表14-1中总结了这些方法的主要特征。根据染料类型、染色步骤和操作时间对染色方法进行了比较。图像质量通过背景效果、点饱和度和染料敏感度进行了评价。  免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
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发布于 ： 2018-08-06
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