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[0069] PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler,反应条件为:预变性95°C5分 钟,变性95°C10s,退火60°C40s,40个循环。每个PCR反应两个复孔。数据分析使用GraphPad Prism 5软件,检验方法为two-tailed Student’s test。最终结果用平均值土SD (标准差) 表不。

[0070] 结果表明,血清和血浆样本都可用于miRNA直接定量RT-qPCR检测,但是血浆中 miRNA检测Ct值全部显著低于血清,说明miRNA在血浆中的表达量显著高于血清(图5)。

[0071] 对比例l、S-Poly⑴Plus方法检测循环miRNA

[0072] S-Poly⑴Plus法检测循环miRNA需要提取核酸,包括以下步骤:

[0073] (一)、提取血清/血浆总RNA

[0074] 在本实施例中提取血清/血浆总RNA,具体步骤为:

[0075] 1)0. IpM线虫miRNA cel-miR-54作为内参提前加入ImL的RNAiso-Plus (TaKaRa) 中,加入IOOyL血清/血浆,吹打混匀,室温静置5分钟;加入200yL氯仿,盖紧离心、管盖,剧烈 振荡20秒;室温静置5分钟;

[0076] 2) 12,000g,4°C离心15分钟;小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,S卩:无色的上 清液(含miRNA)、中间的白色蛋白层、及有颜色的下层有机相;吸取500yL上清液转移至另一 新的1.5mL离心管中;

[0077] 3)向上清液中加入5yL适当浓度的糖原(Applichem)溶液,使糖原终浓度为15yg/ mL,再加入与等体积的异丙醇(505μ〇,上下颠倒充分混匀,-20 °C或-80 °C静置至少10分钟;

[0078] 4) 13,500g,4°C离心10分钟;弃去上清液,向沉淀中加入ImL的75 %乙醇,轻轻颠倒 清洗沉淀;13,500g,4°C离心5分钟,完全弃去上清,如管壁上沾有残余溶液,应再次离心并 弃尽上清;

[0079] 5)沉淀室温干燥2〜3分钟,加入IOOyL RNase-free Water溶解,溶解产物置于-80 °C储存,或者直接进行miRNA的荧光定量PCR检测。

[0080] (二)、S-Poly ⑴ Plus法检测miRNA

[0081] S-Poly⑴Plus法检测miRNA,使用逆转录引物和qPCR引物同实施例1表1,包括以 下步骤:

[0082] Sl、加尾逆转录:miRNA加Poly (A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成)在一个反应体 系中进行,利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。

[0083] 加尾逆转录的反应体系包含:4yL血清总RNA,lyL的0.05μΜ RT primer (逆转录引 物),IU的PolyA Polymerase (多聚腺苷酸聚合_,100U的MMLV (鼠白血病逆转录_,2.5yL 的reaction buffer (反应缓冲液),RNase_free Water (无RNA酶水)补足至10yL。所述 reaction buffer包含200mM Tris-HCl,600mM NaCl,40mM MgC12,4mM ATP,2mM dNTP,pH 8.0。加尾逆转录的反应条件为:37°(:保温3〇1^11,42°(:保温3〇1^11,75°(:保温51^11以灭活酶, 然后迅速置于冰上,静置2min以终止灭活。

[0084] S2、以步骤Sl中逆转录获得的第一链cDNA为模板,Real-time PCR定量检测采用探 针法,所用探针为通用探针,其序列同实施例UReal-time PCR的反应体系如下:

Figure CN107385014AD00091

[0086] PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler,反应条件为:预变性95°C3分 钟,变性95 °C IOs,退火60 °C 30 s,40个循环。每个PCR反应两个复孔。本实施例中相对表达量 用2_~ ACt计算。数据分析使用GraphPad Prism 5软件,检验方法为two-tailed Student’s test。最终结果用平均值土SD (标准差)表示。

[0087] 结果表明,血清和血浆样本都可用于S-Poly (T) Plus法检测miRNA的模板,但是血 浆中miRNA相对表达量显著高于血清,再次验证miRNA在血浆中的表达量显著高于血清(图 6) ο

[0088] 实施例2本发明的Direct S-Poly⑴Plus (DSPP)方法中不同裂解方案的效果比 较

[0089] 在Direct S-Poly (T) Plus方法中,可选用以下六种处理方式中的任一种实现 miRNA从蛋白复合体中裂解出来:

[0090] ①裂解体系:20ul裂解液、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟;

[0091] ②裂解体系:20ul RNase-free water、lul蛋白酶K、20ul样本,;裂解条件:50°C处 理20分钟,然后95 °C保持5分钟;

[0092] ③裂解体系:20ul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条件:50°C处理20分钟,然 后95 °C保持5分钟;

[0093] ④裂解体系:20ul 2Xlysis buffer、20ul样本;裂解条件:75°C保持5分钟;

[0094] ⑤裂解体系:20ul 2Xlysis buffer、lul蛋白酶K、20ul样本,;裂解条件:50°C处 理20分钟,然后95 °C保持5分钟;

[0095] ⑥裂解体系:IOul 2 X lysis buffer、IOul裂解液、Iul蛋白酶K、20ul样本;裂解条 件:50°C处理20分钟,然后95°C保持5分钟。

[0096] 上述处理方式中所述的裂解液包括以下终浓度的组分:2.5%的tween-20,50mM Tris和ImM EDTA;所述2 X lysis buff er包含以下终浓度的组分:100mmol/lTris-HCl、 300mmol/l NaCl、20mmol/l MgCl2;pH为8.0;所述蛋白酶K的终浓度为 15U/mL。

[0097] 其他操作同实施例1。

[0098] 实验结果显示,在上述方案中,单独使用tween 20 (裂解液的主要功能成分,详见 参考文献Zhang Q,0ncotarget,2016,7 (16) :21865-21874)、蛋白酶K或者二者同时使用的 效果都差强人意(分别对应方案①,②,③)。在方案⑤中,使用2X lysis buffer和蛋白酶K 的组合,miRNA的Ct值最小,与方案③相比,降低了0.8〜6.8。方案⑤和⑥对比实验,表明可 能tween 20在裂解miRNA包裹蛋白复合物的同时,也能对poly (A) /RT反应造成不利影响(图 2)。因此,方案⑤在本发明中被推荐为最优方案,裂解反应血浆用量为20〜50ul。

[0099] 实施例3 Direct S-Poly⑴Plus方法中一步法和两步法灵敏度对比

[0100] 在之前的发明S-Poly⑴Plus方法中(专利申请号:201510558101.5),以纯化的 RNA为模板,一步法灵敏度比两步法大大提高。两步法即miRNA Poly㈧加尾完成后再进行 逆转录;一步法即miRNA的Poly㈧加尾和逆转录在同一反应中进行。在本次发明中,以粗提 RNA为模板,操作同实施例1,两步法与一步法的灵敏度再次比较。如图3所示,在Direct S-Poly (T) Plus方法中,本发明方案使一步法的灵敏度比其两步法提高了2.5〜52倍(1.7〜 5.7个Ct值差距)(图3)。

[0101] 实施例4 miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术体系起始粗提RNA加入比例效果对比

[0102] 粗提RNA可能含有一些抑制Poly (A)加尾和逆转录酶活性的成分,因此在Direct S-Poly⑴Plus方法中粗提RNA加入的起始量对方法灵敏度的存在一定影响,采用不同的粗 提RNA起始量,试验操作同实施例1,试验结果如图4,可以看出,当粗提RNA的起始量体积百 分数从0.5%增长至40%时,miRNA的Ct值线性降低。但是当粗提RNA加入的比例升高至60% 和75%时,miRNA的Ct值出现了回复升高。在本发明中,40%的粗提RNA起始量被推荐为最佳 比例。

[0103] 实施例5、热启动DNA聚合酶在Direct S-Poly⑴Plus方法中的作用测试

[0104] 在Direct S-Poly (T) Plus方法体系中,没有RNA的纯化,可能会引入一些基因组 DNA的污染,因此在qPCR中,更容易出现与基因组DNA的错配。减少非特异性扩增的一个有效 方法是热启动,即在热循环开始之前防止或者减少DNA的合成。本实施例对Direct S-Poly ⑴Plus方法中PCR部分所用的普通DNA聚合酶和热启动DNA聚合酶做了对比分析。本实施例 中采取了一种有效的形成热启动的方法,即Taq酶抗体,抗体与DNA聚合酶结合,在热循环开 始之前,酶活不会被启动。本实施例中采用的热启动DNA聚合酶为Hotstart Alpha Taq Polymerase,具体制备方法为 Alpha Taq Polymerase (VitaNavi,St .Louis USA)与 Taq Antibody (菲鹏公司,深圳)等体积混合,室温放置6小时。在图7和图8中可见,使用热启动酶 可以有效减少非特异性扩增。

[0105] 实施例6、Hotstart Alpha Taq Polymerase的用量对Direct S-Poly ⑴ Plus方法 扩增效率的影响

[0106] 本实施例对Hotstart Alpha Taq Polymerase的酶量对miRNA的直接扩增效率做 了分析。从图9中可以看出,Hotstart Alpha Taq Polymerase的活性非常高,20ulPCR体系 中0.0125uL的酶量即可满足扩增要求。

[0107] 实施例7、Hotstart Alpha Taq Polymerase的用量对Direct S-Poly ⑴ Plus方法 中出现的非特异性扩增的影响

[0108] 本实施例探索了不同用量Hotstart Alpha Taq Polymerase对非特异性扩增的影 响,从图10中可以看出,20uLPCR体系加入0.4uL Hotstart Alpha Taq Polymerase会造成 一定的非特异性扩增;如果酶量降低到〇. 0125UL (如图11),非特异性扩增会得到很好地抑 制。

[0109] 实施例8、Direct S-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA的线性梯度范围

[0110] 本实施例对Direct S-Poly⑴Plus方法检测血浆miRNA的线性梯度范围进行了分 析。将血清RNA进行4倍梯度稀释(总RNA使用量对应的初始血浆的用量为0.1-0.0004ul),然 后进行检测。从图12看出,Direct S-Poly⑴Plus方法检测血衆miRNA (hsa-miR_451a,hsa-miR-21_5p,hsa-miR-126_3p,

[0111] hsa-miR-92a_3p,hsa-miR-210_3p,hsa-miR-27b_3p,hsa-miR-103a_3p和hsa-miR-92a-3p)都具有较好的线性相关系数R2

[0112] (0.9139-0.9988)。因此,Direct S-Poly ⑴ Plus方法检测血浆miRNA具有良好的 线性关系和较宽的动态范围。

[0113] 实施例9、Direct S-Poly⑴Plus方法与其他方法比较

[0114] 在本实施例中Direct S-Poly⑴Plus方法将与最为流行的Stem-loop方法和对比 例1中的S-Poly (T) Plus方法做比较。其中Stem-loop和S-Poly (T) Plus的方法是以纯化的 RNA做模板。S-Poly (T) Plus方法同实施例I,Stem-loop方法操作方法则按照试剂盒TaqMan microRNA assay kit (Applied Biosystems)说明书。

[0115] 本实施例中,共用三种miRNA检测方法检测六个miRNA,SPhsa-miR-140-5p,hsa-miR-124a_3p,hsa-miR-16_5p,hsa-miR-93_5p,hsa-miR-25_3p 和 hsa-miR-106_5p。如图 13 所示,除去hsa-miR-16-5p (25 · 43)和hsa-miR-93-5p (27 · 78)的Ct值在S-Poly (T) Plus方法 中略小,其余的miRNA Ct值均在Direct S-Poly⑴Plus方法中最小。Direct S-Poly(T) Plus方法比stem-loop方法灵敏度高出7-342倍(2 · 8-8 · 4个Ct值)。

[0116] 实施例10、Direct S-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱

[0117] 在本实施例中,用Direct S-Poly⑴Plus方法做了六个miRNA的单样本验证,内参 hsa-miR-93-5p为归一化标准,使用血浆样本来自于30个健康志愿者和30个结直肠癌病人。 从图 14可以看出,hsa-miR-22_3p,hsa-miR-423_5p,hsa-miR-144_3p和 hsa_miR-451a 在单 个样本验证中表达量显著上调,hsa-miR-30b_5p表达量显著下调,hsa-miR148a_3p表达量 没有显著变化。

[0118] 对比例2、S-Poly⑴Plus方法分析结直肠癌病人miRNA表达谱

[0119] 在本实施例中,为了验证Direct S-Poly (T) Plus方法得出的结论,再次使用3_ Poly (T) Plus进行六个miRNA的单样本验证,外参cel-miR-54为归一化标准,使用血衆样本 同实施例10。从图15可以看出,六个miRNA的表达趋势与Direct S-Poly⑴Plus方法得到的 结果一致。因此,我们可以得出结论,Direct S-Poly⑴Plus方法是稳定可靠的,并且1183-miR-22_3p,hsa-miR-423_5p,hsa-miR-144_3p,hsa_miR-451a 和 hsa-miR-30b_5p 可以作为 结直肠癌潜在的生物标记物。

[0120] 本发明以S-Poly⑴Plus技术为基础,介绍一种灵敏但无需进行RNA提取的miRNA 检测方法,即miRNA的直接荧光定量PCR扩增技术(Direct S-Poly (T) Plus,简称DSPP)。在 Direct S-Poly⑴Plus方法中,miRNA首先要从蛋白复合物中释放出来,得到粗提的RNA;然 后基于S-Poly⑴Plus方法,粗提RNA在同一反应体系中同时加尾和逆转录。忽略操作时间, 用本发明中的Direct S-Poly⑴Plus方法,cDNA可以在95分钟内制备完成,加上qPCR时间, 140分钟可以完成整个miRNA检测流程。从48个样品中检测1个miRNA,仅需3个小时即可完成 整个操作过程,而提取核酸的方法至少需要一天时间。此项Direct S-Poly⑴Plus技术,将 会极大地简化检测流程、降低成本,更有力的推动循环miRNA肿瘤标志物早日进入临床应 用。

[0121] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员 来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保 护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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