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200237,
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病毒的超低温保存法
大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要
复杂营养的微生物
种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（
如植物的病原性真
菌），通常可用超低温的方法保存（
ATCC1983
；
Halliday
，
Baker1985
）。此法是
将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，
再将这些小管贮存在—
150
～－196℃的液氮中。
超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。
ATCC
常用一种由
二甲基亚砜
（
5
％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细
胞内可避免内
膜的冷冻损伤。
贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将
细
胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做
法是：将封口的小管迅速放入
37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，
将内
容物移入培养基。
超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期
贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括
为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。
2.2
材料
病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（
NuncCryoflex
），液氮罐，防护手套
和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。
2.3
方法
（
1
）剪一段两端各超出冷冻管长度
2cm
的热收缩塑料管。
（
2
）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产
物均可）
冰浴几分钟，
用灭菌移液管将
0.2ml
冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，
并
将盖子拧紧。
（
3
）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。
（
4
）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加
热热收缩塑料管。
（
5
）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。
（
6
）
将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻
（操作时要求戴面罩和手套）
。
（
7
）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、
实验编号和存放日期等。
（
8
）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入
37℃水浴箱中解冻后，用解
剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。
拧开冷冻管的盖子时不需要除去热
收缩塑料管。
