动植物流式专家-科技服务/ 倍性分析解决方案业务内容：
1、科技服务
1）动植物倍性鉴定精确检测该样本是单倍体、二倍体还是三倍体、四倍体等多倍体，对于种质资源、单倍体育种、多倍体育种、非整倍体鉴定具有意义。还可以快速鉴定杂交育种是否成功；
2）基因组大小
预估通过参照物种计算待测样本基因组大小，为之后的基因组测序提供关键信息
3）细胞周期分析可量化
分析细胞周期的不同阶段，得到G1、S、G2期的细胞比例，对于研究辐射诱变育种，药物处理影响细胞周期变化具有意义科技服务核心
优势：
1）数据质量高数万例样本检测经验，严格质控体系，保证结果真实准确
2）报告速度快收到样本一周内即可出具检测报告，加急测试只需1-2天
3）检测样本多基因组大小检测服务已经帮助多家科研机构实现棉花、黄瓜、铁线莲、竹类、螃蟹、湟鱼等多种样本检测，为基因组测序组装提供明确指引
倍性育种整体解决方案
仪器+试剂+耗材+技术指导+售后服务的整体解决方案实现最高效率的倍性分析，无需摸索，即可获取成熟检测方案倍性育种整体解决方案
优势
1）仪器+试剂+耗材+技术指导+售后的综合服务，无需自行摸索实验条件，直接 获得成熟检测方案
2） 无需摸索样本取材、处理、试剂、耗材、数据分析等诸多环节，实验成功率高
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由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb）引起的结核病是一种古老的慢性传染病，并且至今仍是全球死亡人数最多的单一传染病。据世界卫生组织（WHO）报道：2015年全球有1040万新发结核病患者，有180万人死于结核病。Mtb是一种胞内病原菌，可分泌多种效应蛋白至宿主细胞中，进而干扰细胞信号通路和生物学功能，最终促进病原菌在宿主细胞中的存活并导致宿主细胞病变。中国科学院微生物研究所刘翠华课题组长期致力于研究Mtb等重要病原菌与宿主相互作用的分子机制，近年来先后在NatureImmunology,TheJournalofImmunology等杂志发表系列研究工作，发现了Mtb通过分泌一系列效应蛋白调控宿主细胞功能进而逃逸宿主固有免疫清除的新机制，并揭示了病原菌与宿主间相互博弈的动态过程及分子机制，为抗结核药物研发提供了新思路和特异靶点。
近年来，越来越多的研究表明病原微生物（包括多种病毒和细菌等）感染引起的慢性炎症可增加肿瘤发生发展的危险性，有关感染相关的慢性炎症诱发肿瘤的分子机制研究已成为当前生物医学领域的热点之一。然而，Mtb导致的慢性感染与肺癌的相关性至今尚无定论，关于Mtb效应蛋白在肿瘤发生发展中的分子调控机制更是知之甚少。刘翠华课题组之前的研究表明：Mtb效应蛋白PtpA（一种真核样酪氨酸磷酸酶）可被分泌至宿主细胞中结合泛素分子并被后者激活，进而去磷酸化宿主的p-JNK和p-p38并抑制JNK/p38信号通路的激活；同时PtpA还能以磷酸酶活性非依赖性的方式抑制NF-κB信号通路的激活（NatureImmunology,2015）。进一步的研究发现PtpA的宿主互作蛋白TRIM27（一种泛素连接酶）可作为宿主限制因子抑制分枝杆菌在巨噬细胞内的存活，而PtpA则可通过结合TRIM27蛋白的RING结构域而拮抗TRIM27介导的抗病原菌感染免疫功能（ScientificReports,2016）。最近，该课题组又发现PtpA不仅可在宿主细胞质中调控固有免疫信号通路，还可进入宿主细胞核内（图1）。ChIP-seq分析结果提示：PtpA在宿主细胞核内可调控一系列宿主基因的表达，这些基因主要涉及免疫调控（如TNFRSF8）以及细胞增殖和迁移（如GADD45A）等生物学功能。进一步研究发现PtpA可直接结合至GADD45A基因的启动子区并抑制该基因的转录，并进而促进人非小细胞肺癌A549细胞的增殖和迁移能力及其在裸鼠中的成瘤能力，且该调控功能依赖于PtpA的DNA结合能力而不依赖于其磷酸酶活性。此外，受PtpA调控的宿主细胞核内的潜在靶基因中还包括某些与肿瘤发生发展密切相关的非编码RNA基因（如miR-488、CASC2和miR-622）（图2）。该研究发现了首个可进入宿主细胞核内调控宿主免疫及细胞增殖功能的Mtb效应蛋白PtpA，揭示了Mtb可通过其分泌的效应蛋白在特定情况下促进肺癌发生发展的分子机制。
相关结果已在国际权威期刊NatureCommunications《自然通讯》在线发表，题为“ThemycobacterialphosphatasePtpAregulatestheexpressionofhostgenesandpromotescellproliferation”。刘翠华课题组的助理研究员汪静、研究生葛浦浦为该文章的共同第一作者，刘翠华研究员为该文的通讯作者。该研究得到了国家科技部、国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委和中科院的资助。
文章链接：http://www.nature.com/articles/s41467-017-00279-z.pdf
图1.MtbPtpA可进入宿主细胞核内
图2.宿主细胞核内的MtbPtpA抑制固有免疫功能并促进肿瘤细胞增殖的机制示意图
1，如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10Mm的话，将会100%抑制。
2，CCK-8试剂的保存条件？
在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
3，预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
4，CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
5，悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？
悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
6，应该每次做标准曲线吗？
建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
7，有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
8，实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？
需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
9，如果OD值太低，可以采取什么办法？
可以采取2个办法：①适当增加细胞数量。②延长加入CCK-8试剂后的染色时间。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
我做的课题与移植免疫耐受有关，目前在做的就是体外MLR。实验protocol如下：
供体小鼠（Balb/c）脾淋巴细胞经磁珠分选提取APC细胞，辐照灭活后作为刺激细胞。受体小鼠（C57）脾淋巴细胞经磁珠分选提取cd3细胞用CFSE标记作为反应细胞。调整供体细胞密度为5×10^6/ml，受体细胞密度为1×10^6/ml，分别按2:1，5:1，10:1的比例加入圆底96孔板，每组3个复孔，同时设单纯受体细胞和受体自身APC－cd3混合培养作为阴性对照组，37℃5%CO2共培养3天。共培养3天后收集细胞，3个复孔合并成一管，经PBS洗涤，加入CD3-PE流式抗体孵育标记T细胞，上流式细胞仪检测受体T细胞增殖程度。
结果：流式检测结果如下图所示，图3是各浓度梯度组间比较，想请教图中左侧是否为正常的增殖峰，因为此前多次结果均显示为宽大的单峰，未观察到所谓的细胞增殖峰，查阅之前的研究结果多数显示如未加细胞刺激物，单凭细胞的刺激作用形成的增殖相当微弱，极少呈现这样单个高尖的增殖峰。
图1
图2
图3（从上往下（黄、红、蓝）分别为5:1，2:1，10:1混合培养组）
单纯受体细胞的空白组没有增殖这个没有问题，但奇怪的是图4里作为阴性对照的反应组也是同样的双峰结果，尽管刺激效果不如前三组明显，但理论上用自身的APC刺激自身的cd3根本不会出现增殖，不知这样的结果是属于正常增殖还是假阳性结果，因为我们的阴性对照组细胞在镜下看被污染了，是否会受此影响表现为细胞增殖？
因本人刚接触免疫细胞实验不久，可能描述的问题比较小白，如有不当请大神们指正，非常感谢^^
图4（从下往下（黄、蓝、红）分别为空白组、5:1混合培养组和自身对照组）
B、癌胚抗原为肠癌组织产生的一种糖蛋白，故可用于癌细胞的检测，B错误；
下、癌细胞表面糖蛋白减少，故可用于检测细胞癌变的证据，下错误；
D、癌细胞的磷脂分子未发生变化，故不能用于检测细胞癌变的证据，D正确．
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
在课题组例会上做汇报时，有老师对我用CCK-8做细胞增殖实验提出质疑，他说CCK-8是测细胞活力的
想听听大家的意见，不胜感激
1，一个孔中应接种多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
能否用384孔板进行试验？
2，可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。
3，能否用24孔板进行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。
4，酚红会影响检测吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
5，CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？
有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。
6，CCK-8能否检测细菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μlE.coli培养液中加入10μlCCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
7，CCK-8稳定吗？
CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
8，如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？
还可使用450nm到490nm之间的滤光片。
9，如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
10，CCK-8是什么颜色？
应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒
EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。
非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%
（一）原理
细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品
1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法
1.平板克隆形成试验
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
2.软琼脂集落形成试验
本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。
（1）同上（1）~（3）步骤。
（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。
（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。
（4）制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。
（四）实验结果
1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。
2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：
集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100
（五）注意事项
1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。故琼脂高压灭菌( 10磅 15分钟)后按一次用量进行分装。
2.细胞悬液中，细胞分散度>95%。
3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃ ，以免烫伤细胞。
4.接种细胞密度不宜过高。
5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。
原核生物比如大肠杆菌促进增殖药物还不如提供更好的营养条件、足够的环境；抑制类药物如上。
根据细胞种类不同，可能需要不同成分的培养液，来达到促进/抑制的作用
江浙沪皖
