想知道关于干细胞增殖和分化之间的关系

看到有人说干细胞增殖能力强分化能力弱；分化能力强时增殖能力弱

也看到有人实验是抑制细胞分化来促进细胞增殖

想了解一下其中的机制有没有人介绍相关的文献或者是教材资料

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细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。检测

1.MTT。

MTT法检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），而死细胞无此功能。用DMSO溶解甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

MTT法检测细胞增殖算是比较常用的方法了，价格便宜，不过其甲瓒产物不溶于水，需有机溶剂溶解后方可检测，其增加了工作量，同时对结果的准确性产生影响，重复性较差吧。

2.CCK8

CCK8检测原理：CCK8中的主要成分WST®-8能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。

相比较于MTT而言，CCK8的灵敏度要更高，其生成的甲瓒产物溶于水，重复性和准确性上要优于MTT法，对于细胞的毒性较小，不过价格也是相比MTT要贵一截。

3.通过标记DNA检测细胞增殖的常用的大概是Brdu和EDU用的比较多。

Brdu是一种胸腺嘧啶核甘类似物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）参入正在复制的DNA中，之后我们通过抗Brdu的抗体与荧光二抗快速检测细胞的DNA复制活性。EDU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，类似于一种化学反应吧，而无需抗原抗体结合。

相比较而言，Brdu或者edu更适合用于siRNA、miRNA、小分子化合物及其药物筛选等。同时Brdu或者EDU也适用于小鼠，大鼠及其他动物模型的各种组织器官(血管除外)的细胞增殖检测。关于Brdu和EDU的各自优缺点可以参考下帖。具体问题具体分析吧，目前来看EDU检测越来越普遍吧。关于Brdu检测细胞增殖，一种可以使用免疫荧光通过Brdu-FITC与DAPI双染判断细胞的增殖情况。

一般对于细胞来说都是免疫荧光的常规步骤吧，只是需要一步盐酸进行变性DNA和中和。

1.细胞铺板24孔板或者6孔板。可以进行加药处理细胞

2.加入一定终溶度的BrdU继续培养一定的时间。随后弃去孔内溶液，PBS润洗3次。

3.4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS再润洗3次

4.0.1％TritonX-100处理细胞15min后，接着PBS润洗3次

4。接着2MHCl处理30min，再加入0.1M的硼酸中和10min，PBS润洗3次。

5.滴加5％BSA室温封闭30min，弃去液体，滴加1:200稀释的BrdU一抗，4℃孵育过夜。

6.次日，弃去一抗，PBS润洗5次，在避光条件下，滴加1:50稀释FITC标记二抗，室温孵育1h后，PBS再润洗5次。

7.pbs洗5遍，滴加DAPI溶液，室温孵育5到10分钟，PBS洗5遍。

8.荧光显微镜观察。拍照。只是需要注意的是细胞固定这一块吧，如果细胞固定不好的话，细胞容易连在一起而无法分清S期和M期等。同时容易造成细胞碎片吧。

附张失败的图片。

文献中完美的图片：

图片来源：EthanolinducescytostasisofcorticalbasalProgenitors

4.关于EDU，目前一般都是拿试剂盒做的，操作简单方便。步骤相比Brdu而言，少了DNA变性，无需抗体孵育等环节。

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1，CCK-8能否对活细胞进行染色？

不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。

2，CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？

CCK-8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。

3，在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。

4，每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。

5，如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。

6，哪些物质会影响CCK8的测定？

当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

7，在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？

可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

8，设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？

不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

9，说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？

一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。

10，在CCK-8显色过程中，如何终止反应？

有一下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl0.1MHCL溶液。③每孔加10μl的1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。

11，必须预培养细胞吗？

不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

以上内容来自英格恩生物CCK8试剂盒

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