气相色谱层析

（一）基本原理

混合样品的气流通过固定相时，根据各组分对固定相的吸附强弱不同使不同成分得到分离。

利用气相色谱层析技术做为微生物诊断的工具已成功地用于微生物的分类和鉴定。该法敏感性强，能够分离和检测到毫微克的水平。它具有快速的特点，常在数十分钟甚至数小时就可以对传染病做出早期诊断。其结果稳定，重复性好，但不足之处是操作中各因素不易控制，方法不易标化等。

（二）气相色谱仪的基本部件

1．载气常用的载气主要有氮、氩、氢和二氧化碳等。这些气体一般都由高压气瓶供给。

2．进样器气相色谱仪可以用于分离固相、气相和液相标本。液相标本采用微升注射器穿过橡皮隔片注入，气相标本采用特种气相注射器注入。

3．谱柱及加热炉色谱柱一般由金属或玻璃制成，通常采用的柱长2m~4m，内径2mm,毛细管柱长度可达20m～150m，内径为0.2mm。

载体一般采用惰性、多孔的固体颗粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同极性的微生物化合物，为了获得最适的分离条件，要求有不同固定相的载体。目前比较常用的载体有：聚乙二醇（CarbOwax20M）、FFAP（聚乙二醇20M和2-硝基对苯二甲酸的反应产物），OV—17（苯基甲基硅酮）。OV-210、SE-30（甲基硅酮）、ChromosorbG（白色硅藻土载体）等。柱加热炉在温度控制上是非常重要的。

4．纪录仪

5．数据处理装置一般均附有数据处理计算机。

气相色谱仪的基本流程图如下图1-1：

图1气相色谱仪的基本流程

（三）试验条件的选择

1．色谱柱的选择要注意极性及最高使用温度，柱温不能超过最高使用温度。固定相按极性相似的原则选择。

色谱柱的内径大小、长度都能影响分离率。一般而言，内径越小，长度越长，分离效果越好，一般柱长为1m～5m（毛细管柱则20m～100m）。

填充剂颗粒一般采用40目～60目，60目～80目及80目～100目大小。长柱子宜用粒度大些的，以减少柱压降，短柱子则用粒度细的。

气相色谱中固定液的含量对分离效率的影响较大。一般采用固定液与载体重量之比为15︰100～25︰100。采用高灵敏度的检测器，由于进样量减少，固定液含量可以降至5︰100以下。这样可以使用较低柱温，从而提高柱效，缩短分析时间。但固定液用量太少会引起吸附。

2．柱温选择柱温选择对分离度影响很大，常是条件选择的关键。选择的基本原则是：在使最难分离的组分有尽可能好的分离高度的前提下，尽可能采取较低温度，但以保留时间适宜及不拖尾为度。

⑴高沸点混合物（200℃～400℃），若需在较低的柱温下分析，可采用低固定液配比1％～3%，采用高灵敏检测器，柱温可比沸点低100℃～150℃，在200℃～250℃的柱温下分析。

⑵沸点＜300℃的样品，可用3％～25%固定液配比。沸点越低，所用配比越高，柱温可比平均沸点低50℃至平均沸点的范围选择。

3．载体选择载体采用低线速时，宜用氮气；高线速时用氢气。柱越长，柱内有较大压力降，宜用氢气。载气采用低线速时为20ml～80ml/min。

4．其它条件

⑴气化室温度及检测室温度选择：气化温度取决于样品的挥发性、沸点、稳定性以及进样量，一般选择稍高于样品沸点，但不要超过沸点50%以上，以防分解。检测室温度需高于柱温，一般高于柱温30℃左右或与气化室同温。

⑵进样量：固定相在配比15％～35%的层析柱时，最大进样量液体为10μl，气体为10ml。一般样品量液体4μl，气体为0.5ml～3ml，固体小于1mg。

⑶桥电位选择：散热多和选择大的桥电位，在灵敏度相同的情况下，应尽量选择低桥电位，以保护热敏元件。

（四）填充柱的制备

1．称取一定量的载体于蒸发皿中，加2倍于载体体积的低沸点溶剂（氯仿丙酮、三氯甲烷等），使之溶解。

2．取适量的固定液，倒入蒸发皿中，拌匀。注意应使载体全部覆盖在液面下，于红外灯下缓缓加热，不时轻轻搅拌，待溶液全部挥发。

3．先将柱的一端用玻璃毛轻轻堵上，接上吸滤真空泵，柱的另一端接上漏斗，将填充剂从漏斗加入，同时启动真空泵，不时轻敲柱子各部，以使填充均匀。装满后，关闭真空泵，取下色谱柱，将加样的一端也填上一小团玻璃毛。

4．将柱装入色谱柱中，在通载气前，先将炉温升至略高于操作温度，保持约1h，以使固定液受热熔化或粘度减小，在载体表面流布均匀，然后再通入载气，使色谱柱在操作温度下，通载气数小时。

（五）样品处理

以细菌培养物样品的处理为例。

1．取3～5个菌落，接种于2ml含有3%葡萄糖TSB肉汤（即含胰酶1.42%、植物胨0.25%、K₂HPO₄0.25%NaCl、0.42%的肉汤）内，35℃～38℃培养3h。

2．于培养物中加2ml5Mol/LH₂SO₄、H₂O和CH₃OH（1︰3︰16），混合后，再加4ml醋酸乙脂浸取，混匀，静置片刻。

3．4000r/min离心15min，弃沉淀。

4．取上清液加等量乙醚提取，收集乙醚层。

5．于水层中再加上述比例的5Mol/LH₂SO₄、H₂O和CH₃OH混合物。

6．于混合物中加等量氯仿提取，分层，收集氯仿层，弃去水层。

7．将乙醚层与氯仿层合并，挥发浓缩至0.01ml,加10μg已二酸作内标物，再加20μg甲氯基胺－HCl。

8．于混合物中加0.2ml吡啶，再加0.2mlTRI－SIL－BSA和0.05mlTMOS，混匀，60℃孵育1h，离心，去沉淀。

9．上清即可制谱。

（六）操作方法

1．按流程图并参考仪器使用说明书，将有关设备安装好，检查各系统各接头是否漏气，确定无误后，可开始操作。

2．打开气流总阀门，调节表头上的减压阀，使气体压力为22kg/cm²左右，调节稳压器针形阀，使载气流速控制在所需要的流速值。

3．加热色谱柱至所需的柱温并控制此温（根据仪器恒温箱的性能控制温度波动值在一定的范围之内，如±0.5℃）。一般所用的柱温是在被分析物质的平均沸点左右或更低一些。若被分析物的沸程太宽，则可用程序升温法来升高柱温。

4．加热进样器（气化室），使温度高于样品沸点的最高组分的沸点。

5．加热检测器恒温箱，使温度与柱温一样或高于一定的值。

6．气流和温度均达稳定后，给检测器通电流。若采用氢火焰离子化检测器则启动微电流放大器部分。

7．调检样器为零点，待稳定后，即可开始进样。

（七）结果分析

气相色谱层析是一种分离分析的方法，因此它的特点是适合于多组分混合物的定性和定量分析。

1．定性对于一已知范围的混合物，用此法定性很容易，但对于范围未知的混合物来说，则需要配合化学分析及其它仪器分析等。

⑴利用保留值定性法：同一种物质在一根层析柱上保留时间相同。取样品各可能组分的纯物质加入样品中，混合进样，对此加入后的色谱图，若某色谱峰相对谱高，则该色谱峰的组分与纯物质可能为同一物质。

⑵化学反应定性法：即把色谱柱的流出物，通过官能团试剂中，观察试剂的颜色是否发生变化或是否有沉淀，而判断该组分含什么官能团或属于何类化合物。

⑶两谱联用定性法：即利用质谱仪、红外分光光度计等来进行测定，定性。

2．定量在实验条件恒定时，峰面积或峰高与组分的含量成正比，因此可以利用峰面积或峰高面积或峰高来进行定量。对于微生物标本的气相色谱分析常根据以下几点来进行比较。

⑴峰的有无和峰的大小。

⑵按10个重复标本分析计算的平均t值（标准差）。

⑶同标准化合物的相对保留时间进行对比，而对某化合物做出鉴定。