| 实验方法原理 | pAcHLT-A-、B-、C-转移载体（Pharmingen）和pBlueBacHis-A-、B-、C-载体(Invitrogen)在多克隆位点（MCS）前存在编码6个组氨酸残基的N端标签的DNA序列。每个载体的MCS含有不同可读框，可简化克隆。表达的重组蛋白为6×His融合蛋白，可用Ni-NTA琼脂糖进行纯化。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 昆虫细胞裂解液（含1×蛋白酶抑制剂） 试剂、试剂盒 | Ni-NTA琼脂糖6×His洗脱缓冲液 仪器、耗材 | BeckmanGPR离心机Sorvall离心机／0.2μm滤器适当的层析柱 实验步骤 | 1.用扩增的重组病毒感染适当数量的细胞（如每个100mm培养皿中5×106细胞），MOI为5～10。培养3～5天，直到细胞出现典型的病毒感染状态。 2.用无菌吸管轻轻吹打细胞，收集细胞和上清液，转移到离心管中。 3.4℃，1000g离心10min。如果目的蛋白为分泌性蛋白，将上清转移到新管中，进行纯化（步骤6)。如果目的蛋白为胞内蛋白，弃上清，洗涤细胞，将细胞沉淀在PBS中重悬，离心，弃上清。 4.每1×107细胞加入1ml含1×蛋白酶抑制剂的昆虫细胞裂解液，在冰上放置45min。 裂解缓冲液根据细胞类型的不同而不同，6×His融合产物不能用含EDTA的裂解缓冲液。 5.通过4℃，40000g离心30min，澄清裂解液，沉淀为细胞碎片；或将裂解液过0.2/nm的滤器。 6.轻轻的重悬Ni-NTA琼脂糖，将其倒入适当的层析柱中，使树脂自然沉降，柱中液体流尽，然后用3～5倍的6×His洗涤缓冲液洗柱2次，以去除附着的乙醇。让柱中液体流尽。每1ml的Ni-NTA琼脂糖可吸附5～10mg6×His融合蛋白。 7.将澄清的裂解液上柱，调整柱的流速，最大为每小时5倍柱体积。 8.用10倍床体积的6×His洗涤缓冲液洗柱，柱中液体流尽，同时测量A280的值。继续洗柱（大约4次），直到流出液的A280<0.01。弃洗液。 9.加入3倍床体积的6×His洗脱缓冲液（含有一阶梯度或线性梯度的咪唑），将流速调至1ml/min每毫升树脂。分别收集洗脱液直到柱中液体流尽。 使用BioColors-His杆状病毒转移载体（Pharmingen）生产的融合蛋白，其目的基因含有GFP和组氨酸标签。在紫外光下，整个纯化过程中，重组融合蛋白是可见的，这有利于建立最佳的纯化过程。 注意事项 | 裂解缓冲液根据细胞类型的不同而不同，6×His融合产物不能用含EDTA的裂解缓冲液。 其他 | |
