Preparation of cell lysates from E. coli by enzymatic lysis...
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PreparationofcelllysatesfromE.colibyenzymaticlysisMaterialsChemicalsLysisbuffer| 50mMTris-HClpH7.5 50-200mMNaCl* 5%glycerol(v/v) 1mMDTT 1mMPMSF | * | TheNaClconcentrationusedinthelysisbufferdependsfullyontheapplication.IncaseofaffinitychromatographyonaNi-columntheNaClconcentrationisusually200mMbutwhenthefirstpurificationstepisionexchangechromatographynosaltshouldbeadded. |
Stocksolutions| 1mg/mlDNaseandinwater | | 100mMPMSF(phenylmethylsulfonylfluoride)inisopropanol | | 1MMgCl2 |
Procedure| 1. | ResUSPendthecellsinchilledlysisbufferinaratioof1gcellwetweightto1mllysisbuffer.- AddthePMSF(10µlPMSF(100mM)permlofcelsuspension)atthispoint.
| | 2. | Addlysosymetoafinalconcentrationof300µg/mlandincubatethecellsuspensionat4°Cfor4h. | | 3. | Add5µlMgCl2(1M)and1µlDNasesolution(1mg/ml)permlofcellsuspensionandincubatethesolutionat4°Cfor30min. | | 4. | Removecelldebrisbyultracentrifugationat4°Cfor30minat45000rpmusinga45Tirotor(Beckman). |
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