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tmxk1fwow
用户
4. siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
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xiaoyu0319
用户谢谢楼主
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liuzeyi2002
用户补充点！首先外源性或细胞内源性的dsRNA与胞内的RNAi核酸酶(如Dicer)相结合,之后dsRNA被RNAi核酸酶切割成21～23nt的小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA),此siRNA含有2～3nt的3′突出端,被输送到RISC(RNA-in-ducedsilencingproteincomplex),siRNA作为引导序列引导RISC与同源性的mRNA结合,解旋酶催化mRNA与siRNA的正义RNA链相互交换,siRNA的反义链与同源mRNA结合后,核酸酶在mRNA与siRNA反义链所形成的双链区的5′起始端下游7～10个核苷酸处(也就是双链区的靠近中间位置)切断mRNA,降解的mRNA被释放后,siRNA双链重新形成,可以继续降解同源的mRNA
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liuzeyi2002
用户希望有做这方面的战友，多多发表心得！
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huaruishi
用户有没有人用病毒做载体进行RNAi的呢？我现在是菜鸟，有很多问题想请教大家。
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tmxk1fwow
用户4.siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
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liuna8391
用户想请教一个问题，VIGS毕竟是利用病毒来做载体的，我是做观赏植物RNAi的，这样不会对植物产生很大的影响吗？就算试验最后成功了，我育出的品种也没什么价值呀，因为它本身就是带病毒的，没法推广。
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茯苓猪爱
用户有时间认真学习一下，呵呵
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kidandmoon
用户受益良多！
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xingxuevic
用户喜欢，谢谢了
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小呆和小瓜
用户你好，我最近找公司合成了三段siRNA，结果转染效率很低，三个片段效果差不多，干扰效果都不太好。望指教啊~~~！
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jin_henjin
用户高手啊，我才起步，谢谢啦！
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lili39
用户新手上路，受益匪浅，谢谢
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jiyuyan168
用户谢谢。收藏了
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蘑菇头老鼠
用户收藏收藏，新手
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韩宏晓
用户高手，以后要常来学习学习了
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sophia429
用户好东西！可是解压不了啊！！
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马晓艳05_fly
用户学习了！
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bikaqiucc
用户虽然是很久之前的帖子，觉得非常不错，谢谢了
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晓晓317481504
用户请问有大侠做过关于活体内的（大鼠）的干扰实验？用病毒包装的？谢谢
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摘星客2223
用户晓晓317481504请问有大侠做过关于活体内的（大鼠）的干扰实验？用病毒包装的？谢谢我将要做这方面的实验，查找文献，找到了一种活体内沉默某种miRNA的文献，是通过注射化学修饰的寡核苷酸antagomirs实现的，也许对你可能有帮助lencing_of_microRNAs_in_vivo_with_‘antagomirs’.pdf(451.33k)
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zmzpxsz
用户mark！
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ashley200888
用户好贴...
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cindy630
用户thanksalot!
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vivijo
用户真好！谢谢大家！
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zzz0532
用户收藏，留用
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武宣萍
用户非常感谢楼主
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didiwu
用户谢谢楼主
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杨树林117
用户太好了，希望大家都能看到
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浅浅暖
用户收藏了
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天边的线
用户谢谢分享。
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fujingqi
用户请教：siRNA同源的mRNA降解是整条mRNA都降解，还是同源区域附近？如果只是降解同源区域附近，是不是还能有蛋白片段表达出来？谢谢
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wxk_05
用户谢谢楼主，学习了~
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