【求助】关于RNA干扰载体构建的连接反应？
2021-09-16
问题描述：
我现在在做RNA干扰载体构建的连接反应，我将退火的目的片段与酶切后的载体片段（浓度很低）做了连接之后使用大肠杆菌DH5α进行转化，可是做了三次不同的连接反应，转化了三次都失败了，不知道什么原因？我考虑：（1）是不是连接反应体系有问题？（2）oligo的退火有问题？还是技术环节上有什么不足？希望大家能给予宝贵意见。
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welloff
用户
你应该平行地做2个对照，空白对照和阳性对照（一般公司试剂盒会提供一个对照）。不要总怀疑转化问题，问题很大程度上是在连接上。如果连阳性对照都出不来，就得考虑考虑你的连接体系。RNA1的oligo的退火是比一般的双链退火要复杂一点，应采取慢退火的方法。你可以将oligo混合物放在PCR仪上，PCR仪升到94度后，关闭PCR仪，然后让PCR仪自然降到室温就可以了。
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welloff
用户你应该平行地做2个对照，空白对照和阳性对照（一般公司试剂盒会提供一个对照）。不要总怀疑转化问题，问题很大程度上是在连接上。如果连阳性对照都出不来，就得考虑考虑你的连接体系。RNA1的oligo的退火是比一般的双链退火要复杂一点，应采取慢退火的方法。你可以将oligo混合物放在PCR仪上，PCR仪升到94度后，关闭PCR仪，然后让PCR仪自然降到室温就可以了。
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sdplwill
用户谢谢！我有个很幼稚的问题想请教，我所购买的质粒载体中有个阳性对照的质粒，这个质粒该怎么使用呢？另外，是不是和我的连接反应温度有关系？根据RNAi相关的文献报道中都是4°放置>16小时,但是其他方面的文献中关于载体构建的连接大多都是16°放置16小时。
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