作者单位:215003江苏省苏州大学附属儿童医院中心实验室・综述・基因敲除的新技术———RNAi金美芳综述 朱雪明审校【摘要】 RNA干扰(RNAi)是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分予介导,特异降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,自1995年首次报道以来已取得了重大研究进展。近8年来,研究者对RNAi现象进行了广泛、深入的探索研究,预示RNAi有望成为今后分析人类基因功能的有力工具,并将在人类疾病的基因表达显像和治疗方面发挥重要作用。【关键词】 RNA干扰; 基因敲除; 基因沉默中图分类号:R457.4文献标识码:A文章编号:167324130(2007)1121016204基因敲除是一种反向的遗传学研究方法,是八十年代后发展起来的一种新型的分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,但此技术较复杂且成功率不高。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA干扰(RNAinterference,RNAi),它们同样可以达到基因敲除的目的。其中RNAi由于方法简便,周期较短,因此近几年来越来越多的基因敲除采用了RNAi方法[1～3]。RNAi是指双链RNA诱导同源mRNA降解导致基因表达抑制的现象,又称基因沉默.是一种转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)现象,是生物体在进化过程中抵御病毒感染及防御重复序列和突变引起基因组不稳定的保护机制。RNAi现象的发现1995年,Ouo等发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par21基因的表达,该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年,Fire等证实Guo等发现正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量内源或外源双链RNA(double2strandedRNA,dsRNA),而引发并将这一现象命名为RNAi。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马壁等多种真核生物中,并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑带(quelling)现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。RNAi阻断基因表达的机理双链RNA进入细胞后,能够在Dicer酶的作用下被裂解成小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),而另一方面双链RNA还能在RdRP(以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA2di2rectedRNApotyraerase,RdRP)的作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。siRNA的双链解开变成单链,并与某些蛋白形成复合物,Argonaute2是目前唯一己知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合,一方面使mRNA被RNA酶裂解,另一方面以siRNA作为引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siR2NA也具有诱发RNAi的作用,通过这个聚台酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制。从21～23个核昔酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi,但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。RNAi基因敲除的优点1.比同源重组法更加简便,周期大大缩短。2.对于哺乳动物,如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。3.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达,它成为研究信号传导通路的良好工具。4.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因,如可用RNAi来阻断某些基因的表达,来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用。siRNAs的制备方法目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括:化学合成、体外转录、长片段dsRNAs经RNaseⅢ类降解(如Dicer,E.coli,RNaseⅢ)、siRNA表达载体或病毒载体在细胞中表达siRNAs、PCR制备的siRNA