实验步骤 | SV40体外传递系统材料试剂 ATP(100mmol/L;Roche) 10mmol/LHEPES(pH7.9) 10mmol/LKCl 0.lmmol/LEDTA 0.1mmol/LEGTA 用0.22um滤膜过滤灭菌。缓冲液I能在4°C保存30d。 使用前加入: lmmol/L二硫苏糖醇(DTT) 在ImlPBS中溶解1片蛋白酶抑制剂(Roche1873580),用缓冲液I1:50稀释。 缓冲液II 20mmol/LHEPES(pH7.9) 0.4mmol/LNaCl 0.lmmol/LEDTA lmmol/LEGTA 用0.22um滤膜过滤灭菌。缓冲液II能在4℃保存30d。 使用前加入: lmmol/LPMSF lmmol/LDTT 在ImlPBS中溶解1片蛋白酶抑制剂(Roche1873580),用缓冲液11:50稀释 CaCl2(10mmol/L) 细胞 用于研究的细胞系 在培养皿或悬浮维持要转化的细胞系。 草地夜蛾(Sf9)细胞 细胞生长培养基(含有乳清蛋白和yeastolate的Grace昆虫培养液) 完全生成培养基 使用所研究细胞系合适的培养基。 MgCl2(200mmol/L) NonidetP-40(NP-40;10%V/VinPBS) 磷酸盐缓冲液(PBS) 质粒DNA(可达17.7kb) 要获得最高体外包装效率,使用CsCl—氯化铯密度梯度平衡离心纯化质粒DNA。 小干扰RNA(siRNA) VPl杆状病毒 通过引人一’个DNA片段(SV40上1463^〜2770)到由Aw吨ra灿acW/omicanuclearpholyhedrosis病毒(AcMNPV)衍生(LuckowandSummers1988)的pVL1393质粒(PharMingen,SanDiego,California)中,进行VPl的克隆(PharMingen,SanDiego, 仪器 培养箱(恒湿,37°C,5%CO2) 离心管(40ml,无菌,Sorvall) 微型离心管(1.5ml) 搅拌培养瓶(250ml) 组织培养皿(60mm) 有微型离心管平台的涡旋混合器 恒温水浴锅(37°C) 方法 转化Sf9细胞 1.在250ml培养瓶中,以感染复数为10的VPl杆状病毒感染新鲜培养的5X1〇8Sf9细胞。 不建议放大到500ml。 核蛋白提取 感染后4〜5d收集Sf9细胞。收获细胞的时间由vpl的表达水平及核提取物的包装功能决定。 2•把转化后的细胞从250ml培养瓶转移到预冷的40ml试管中。 3•准备缓冲液I和II。放置在冰上。预冷微型离心管。 4.用冷的PBS清洗细胞三次,每次在4°C,6000r/min离心5min。 5•去上清。涡旋使沉淀完全重悬 这一步不要冷冻。 6•加入Iml缓冲液I。轻轻吹打使沉淀重悬直到完全分散。 7.慢慢加人28ml缓冲液I。在冰上孵育15min。 8•加人2.3ml10%NP-40。涡旋混合10s。 9•在冷冻离心机(约4°C)中13000r/min离心3min。 10.用连接真空吸气器的吸头去除上清。、细胞核内物质在沉淀中。 11•涡旋振荡沉淀。加人5ml缓冲液II。充分混合后转移到微量离心管中。 每管的总体积本要超过lml。 I2.把管子放在连接到振荡器的平台上。4°C涡旋混合15min。 13.4C,13000r/min离心微量离心管5min。 14•将核提取物上清分装到预冷的管子里。 15•测定核提取物的蛋白质浓度。 注意到核提取物含有NP-4〇。并不是所有测定蛋白质浓度的方法都和N1mo兼容。只有当浓度起过3mg/ml才能用于体外包装。 16•在一20〜一8℃储存核提取物。 |
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