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SV4 0 的体外包装: 一种假病毒体基因递送系统 实验方法
来自 : 蚂蚁淘
实验步骤

SV40体外传递系统

材料

试剂

ATP(100mmol/L;Roche)

缓冲液I

10mmol/LHEPES(pH7.9)

10mmol/LKCl

0.lmmol/LEDTA

0.1mmol/LEGTA

用0.22um滤膜过滤灭菌。缓冲液I能在4°C保存30d。

使用前加入:
0.5mmol/Lphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)

lmmol/L二硫苏糖醇(DTT)

在ImlPBS中溶解1片蛋白酶抑制剂Roche1873580),用缓冲液I1:50稀释。

缓冲液II

20mmol/LHEPES(pH7.9)

0.4mmol/LNaCl

0.lmmol/LEDTA

lmmol/LEGTA

用0.22um滤膜过滤灭菌。缓冲液II能在4℃保存30d。

使用前加入:

lmmol/LPMSF

lmmol/LDTT

在ImlPBS中溶解1片蛋白酶抑制剂(Roche1873580),用缓冲液11:50稀释

CaCl2(10mmol/L)

细胞

用于研究的细胞系

在培养皿或悬浮维持要转化的细胞系。

草地夜蛾(Sf9)细胞

培养基

细胞生长培养基(含有乳清蛋白和yeastolate的Grace昆虫培养液)

完全生成培养基

使用所研究细胞系合适的培养基。

MgCl2(200mmol/L)

NonidetP-40(NP-40;10%V/VinPBS)

磷酸盐缓冲液(PBS)

质粒DNA(可达17.7kb)

要获得最高体外包装效率,使用CsCl—氯化铯密度梯度平衡离心纯化质粒DNA。

小干扰RNA(siRNA)

VPl杆状病毒

通过引人一’个DNA片段(SV40上1463^〜2770)到由Aw吨ra灿acW/omicanuclearpholyhedrosis病毒(AcMNPV)衍生(LuckowandSummers1988)的pVL1393质粒(PharMingen,SanDiego,California)中,进行VPl的克隆(PharMingen,SanDiego,
California)。然后经限制性内切核酸酶SmaI和BgZII(SandalonandOpperiheim1997,2001)消化。分装病毒储液,保存在一80°C中。

仪器

培养箱(恒湿,37°C,5%CO2)

离心管(40ml,无菌,Sorvall)

微型离心管(1.5ml)

摇床

搅拌培养瓶(250ml)

组织培养皿(60mm)

有微型离心管平台的涡旋混合器

恒温水浴锅(37°C)

方法

转化Sf9细胞

1.在250ml培养瓶中,以感染复数为10的VPl杆状病毒感染新鲜培养的5X1〇8Sf9细胞。

不建议放大到500ml。

核蛋白提取

感染后4〜5d收集Sf9细胞。收获细胞的时间由vpl的表达水平及核提取物的包装功能决定。

2•把转化后的细胞从250ml培养瓶转移到预冷的40ml试管中。

3•准备缓冲液I和II。放置在冰上。预冷微型离心管。

4.用冷的PBS清洗细胞三次,每次在4°C,6000r/min离心5min。

5•去上清。涡旋使沉淀完全重悬

这一步不要冷冻。

6•加入Iml缓冲液I。轻轻吹打使沉淀重悬直到完全分散。

7.慢慢加人28ml缓冲液I。在冰上孵育15min。

8•加人2.3ml10%NP-40。涡旋混合10s。

9•在冷冻离心机(约4°C)中13000r/min离心3min。

10.用连接真空吸气器的吸头去除上清。、细胞核内物质在沉淀中。

11•涡旋振荡沉淀。加人5ml缓冲液II。充分混合后转移到微量离心管中。

每管的总体积本要超过lml。

I2.把管子放在连接到振荡器的平台上。4°C涡旋混合15min。

13.4C,13000r/min离心微量离心管5min。

14•将核提取物上清分装到预冷的管子里。

15•测定核提取物的蛋白质浓度。

注意到核提取物含有NP-4〇。并不是所有测定蛋白质浓度的方法都和N1mo兼容。只有当浓度起过3mg/ml才能用于体外包装。

16•在一20〜一8℃储存核提取物。

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