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| 实验材料 | 羧苄青霉素氯霉素大肠杆菌CJ236 试剂、试剂盒 | 生理磷酸缓冲液超纯甘油PBS-T缓冲液PBS-T-BSA缓冲液 仪器、耗材 | 2YT培养基SOC培养基 实验步骤 | 下述方法描述了P8库的设计（见12.3.1)、构建（见12.3.2)、选择（见12.3.3.1)和筛选（见12.3.3.2)，依此来鉴定能改进蛋白质表达水平的突变体。我们描述了利用前述噬菌粒——pS1607改进hGH表达水平的方案。这一方法也适用于任何其他靶蛋白。唯一的改变就是用表达靶蛋白的噬菌体粒取代pS1607以及用高亲和性 的靶蛋白配体取代hGH结合蛋白。 3.1库的设计 我们前面已经提及在噬菌粒表达系统中P8的N端部分极度耐受突变，其中有些突变能增加异源融合蛋白的展示水平[10，11]。随后，我们发现P8的N端只有6个野生型残基侧链（Ala7、Ala9、Ala10、Phe11、Leu14和Ala18)对P8有效包装到噬菌体外壳是必需的[10，12]。这些侧链形成一个紧密的疏水抗原决定簇（图12.1)，在噬菌体组装过程中起到关键作用。环绕这一决定簇的残基突变能增加包装效率，从而增加异源蛋白 的展示水平[10]。基于这些研究，我们鉴定出了7个位点（Pro6、Lys8、Asn12、Ser13、Gln15、Ala16和Ser17)，这些位点的突变最可能改进蛋白质展示水平（图12.1)。蛋白质内7个位点的完全随机化能导致接近109的独特氨基酸组合，这一多样性能够被这里所描述的制备库的约1010的多样性所覆盖。  3.2库的构建 P8变异库用前述寡核苷酸诱导突变法的优化版本[2]来构建。首先，一条突变的寡核苷酸（序列：GTAATAATAAGCGACCGAATATATC)用于在随机化位点引入终止密码子；12.3.2.2节中提供的寡核苷酸诱导的位点特异的突变方案可以用于小规模突变来引入终止密码子（见注1)。终止密码子的引入消除了野生型蛋白的表达，所以“终止模板”噬菌粒可以作为模板用来建库。含尿嘧啶的单链DNA终止模板（从宿主中纯化的）和突变寡核苷酸（序列：GCCGAGGGTGACGATNNKGCATAAGCGGCCTTTNNKNNKCTGNNKNNKNNKGCGACCGAATATATC)进行退火，这样就能用编码20种氨基酸的NNK(N=A/G/C/T，各25%；K=G/T，各50%) 取代终止密码子。突变寡核苷酸链作为引物合成一条互补的DNA链，最终形成一个共价闭环双链异质DNA(CCC-dsDNA)。建库完成后，CCC-dsDNA通过电转化法引入宿主中，在宿主中错配按照野生序列或突变序列进行修复。在ung+菌株中，dU模板链倾向于失活，而合成的突变链被增殖，这样就实现了有效突变（大 于50%)。用随机化位点均为终止密码子的序列做模板保证了只有完全突变的克隆才含有可读框，才能在噬菌体表面展示。与辅助噬菌体一起转化宿主大肠杆菌，库里的各成员就能包装进噬菌体颗粒。 3.2.1纯化dU-ssDNA模板 突变效率依赖模板的纯度，因此高纯度dU-ssDNA的应用对库的成功构建至关重要。我们用QiagenQIAprep Spin M13Kit来纯化dU-ssDNA，下面就是Qiagen方案的一个修改版。对一个中等拷贝的噬菌粒而言（如PS1607，其包含pBR322的骨架），这个方案至少能获得20μg的dU-ssDNA，这足以满足建库的需要（见注2)。 (1)从新鲜的LB/抗菌素板上挑出一个含有某噬菌粒的E.coliCJ236(或者其他dut-/ung-)菌株的单克隆放入1ml2YT加有M13KO7helper噬菌体（1010pfu/ml)和相应抗菌素的培养基中以保持宿主F"附加体和噬菌粒。例如，2YT/Carb/cmp培养基中含有羧苄青霉素来选择带有内酰胺酶基因的噬菌粒，而氯霉素用来选择CJ236 F"附加体。37°C及200r/min下摇动2h并且加入卡那霉素（25μg/ml)来选择被M13KO7共转染的带有卡那霉素抗性基因的克隆。在37°C及200r/min下摇动6h后，转移培养到30ml的2YT/carb/kan/uridine培养基。再在37°C及200r/min下摇动过夜。 (2)在4°C27000g下（15000r/min在SorvallSS-34转子中）离心10min。转移上清液到含有1/5体积PEG/NaCl的新试管中，室温孵育5min。在4°C12000g下(10000r/min在SorvallSS-34转子中）离心10min。移走上清液，在2000g(4000r/min)下短暂离心，吸出残余上清液。 (3)在0.5ml的PBS中重新悬浮起噬菌体沉淀小团，转移到一个新的EP离心管中。在桌式小离心机中用14000g离心5min，转移上清液到新的EP离心管中。 (4)加入7.0μlMP缓冲液（Qiagen)，混匀。室温孵育至少2min。 (5)在2ml小离心试管的QIAprepspincolumn（离心层析柱，Qiagen）中加入上述样品。在桌式小离心机中6000g离心30s。遗弃流出液。噬菌体颗粒仍然结合在层析柱介质中。 (6)在柱中加入0.7ml的MLB缓冲液（Qiagen)。6000g离心30s，弃流出液。 (7)在柱中再加入0.7ml的MLB缓冲液。室温孵育至少1min。6000g离心30s。弃流出液。噬菌体DNA与壳蛋白分离，仍然吸附在层析柱介质中。 (8)加入0.7ml的PE缓冲液（Qiagen)。6000g离心30s，弃流出液。 (9)重复步骤（8)，去除残余的蛋白质及盐。 (10)6000g离心30s，将小层析柱转移到一个新的1.5mlEP离心试管中。 (11)加入100μl的EB缓冲液（Qiagen:10mmol/LTris-HCl，pH8.5)到层析柱膜的中心部位。室温孵育10min，然后6000g离心30s。保存流出液，其中包含纯化的dU-ssDNA。 (12)分析上述DNA，用1.0μlDNA溶液进行TAE琼脂糖凝胶电泳。结果DNA应该是明显的单一条带，但是也经常可以观察到一些较低电泳迁移率的弱带（见图12.2中泳道2)。这些弱带很可能是由于ssDNA的二级结构所致。 (13)利用260nm的吸收值（A260=1.0相应于33ng/μl单链DNA)测定DNA浓度。典型DNA浓度范围应该为200~500ng/μl。 3.2.2体外合成异源双链CCC-dsDNA 用dU-ssDNA作为模板，经过三步程序就能把突变寡核苷酸包装到异源CCC-dsDNA内。这里描述的方案是前述方法的改进和规模扩大化的版本[13]。寡核苷酸先进行5"磷酸化，然后和dU-ssDNA模板退火。寡核苷酸链通过延伸和连接形成异源CCC-dsDNA(图12.2中泳道3)，然后再进行纯化和脱盐。这一方案能获得大约20μg高纯度、低电导率的CCC-dsDNA。这足以构建容量超过1010的库（见注3)。  1)用T4多聚核苷酸激酶磷酸化寡核苷酸 (1)在1.5mlEP离心管中混合加入0.6μg突变寡核苷酸、2.0μl的10XTM缓冲液、2.0μl的10mmol/L ATP和1.0μl的100mmol/LDTT。加水到总体积为20μl。 (2)往上述体系中加入20U的T4聚核苷酸激酶。37°C孵育1h(见注4)。 2)寡核苷酸和模板一起退火 (1)在20μl磷酸化反应混合物中加入20μg的dU-ssDNA模板（来自12.3.2.1)、25μl的10XTM缓冲液，加水到总体积为250μl。假设寡核苷酸与模板长度比是1:100，上述DNA的量给出寡核苷酸与模板摩尔比为3:1。 (2)90°C孵育3min、50°C孵育3min、20°C孵育5min(见注5)。 3)合成CCC-dsDNA (1)在已经退火的寡核苷酸与模板混合物中加入10μl10mmol/LATP、10μl25mmol/L的dNTP、15μl100mmol/LDTT、30WeissU的T4DNA连接酶以及30U的T7DNA聚合酶。 (2)20°C孵育过夜。 (3)利用QiagenQIAquickDNA纯化试剂盒，对上述DNA进行亲和纯化及脱盐。加入1.0ml的QG(Qiagen)缓冲液混合。 (4)将上述样品放入两个置于2ml离心试管中的QIAquickspin离心层析柱。在桌式小离心机中用14000g离心1min，去除流过液。 (5)在每个柱子中加入750μl的PE缓冲液（Qiagen)。14000g离心1min。去除流过液，再13000r/min离心1min。将层析柱置于新的1.5mlEP小离心管。 (6)在层析柱膜的中心部位加入35μl的USP超纯水。室温孵育2min(见注6)。 (7)14000g离心1min洗提出DNA。混合两个管中的洗提液。得到的DNA可以立即进行大肠杆菌电转化实验，也可冻存以备后用。 (8)同时与dU-ssDNA模板电泳1.0μl的上述洗提出的反应产物。用含有溴化乙锭（EB)的TAE琼脂糖凝胶电泳来检测DNA(图12.2及注7)。 一个成功的反应能使dU-ssDNA完全转化成低电泳迁移率的dsDNA。通常，至少能看到两条产物带并且不存在dU-ssDNA(图12.2)。其中电泳迁移率较高的带就是所需的产物——正确延伸和连接的CCC-dsDNA，可以用于有效转化大肠杆菌并且提供较高突变效率（约80%)。而电迁移率较低的带是由T7DNA聚合酶星号活性所致的单链异常产物[14]，其突变率较低（约20%)，转化效率也只有CCC-dsDNA的1/30。如果ssDNA模板的重要部分转化为CCC-dsDNA，那么就能得到一个高突变、高多样性的库。有时能得到电迁移率介于前述二者之间的第3条带，这条带被正确延伸但是没有连接的dsDNA(图12.2)。产生这一条带的原因要么是T4DNA连接酶活性不够，要么就是寡核苷酸磷酸化不完全。 3.2.3大肠杆菌电穿孔和噬菌体扩增 要完成库构建，异源CCC-dsDNA还必须引入含有F"附加体的大肠杆菌宿主中。M13噬菌体能侵染这种宿主并在其中增殖。噬菌体展示库的多样性还受限于DNA引入大肠杆菌的方法，其中高压电转化法的效率最高。 我们构建了一个大肠杆菌菌株——SS320，这是高效电转化和噬菌体增殖的理想菌株[2]。用标准的噬菌体杂交方案[15]，我们将F"附加体从E.coliXL-1Blue(Stmtagene)转入E.coliMC1061(Bio-Rad)。E.coliMC1061的染色体标记有链霉素抗性，而E.coliXL-1Blue的附加体含有四环素抗性，这样杂交产生的子代菌株可以通过链霉素和四环素双抗进行选择。E.coliSS320保留了E.coliMC1061的高电转化效率，同时F"附加体的存在使得M13噬菌体感染宿主成为可能。 (1)将上述纯化好的DNA(来自3)，约20μg置于最小体积）及0.2cm间隙的电转槽置于冰上冷却。在冰上融化350μl分装好的电转感受态E.coliSS320细胞。将感受态细胞加入DNA中且用移液枪吸放数次混合（避免产生气泡）。 (2)转移混合物于电转槽中进行电穿孔转化。电穿孔转化操作时，应遵循仪器厂家的指导手册，建议使用BTXECM-600电转化仪时应设置：场强2.5kV，电阻129Ω，电容50μF。也可以使用BioRad的GenePulser电转化仪及如下设置：场强2.5kV，电阻200Ω，电容25μF。 (3)立即在电穿孔转化后的电转槽中加入1mlSOC培养基以营救这些细胞并且转移培养基到一个250ml的锥形瓶中。用1mlSOC培养基冲洗电转槽两次。再向瓶中加入SOC培养基到终体积为25ml，在200r/min摇床37°C孵育20min。 (4)要确定所建库的多样性，可以在LB/carb培养皿中系列稀释涂板来选择适当的噬菌粒（如带有β-内酰胺酶基因的噬菌粒pS1607)。 (5)加入M13KO7helper噬菌体（4X1010pfu/ml)，在200r/min摇床37°C孵育10min。 (6)转移培养液于含有500ml2YT培养基的2L锥形瓶中，加入合适的抗生素进行噬菌粒选择（如2YT/carb培养基）。 (7)在200r/min摇床37°C孵育1h且加入25μg/ml的卡那霉素。然后在200r/min摇动下37°C孵育过夜。 (8)将上述培养液在4°C及16000g下（10000r/min在SorvallGSA转子中）离心10min。转移上清液到含有1/5体积PEG/NaCl的新试管中以沉淀噬菌体。室温孵育5min。 (9)在SotvallGSA转子中4°C及16000g下离心10min。去除上清液。再简短离心一下，用移液管吸走上清液残余。重新悬浮噬菌体小团于1/20体积的PBS中。 (10)在4°C及27000g下（在SorvallSS-34转子中，15000r/min)离心5min以去除不溶性杂质。转移上清液于一个干净试管。 (11)利用分光光度计估计噬菌体浓度（268nm的光密度[OD268] =1.0时溶液中噬菌体浓度约为5X1012噬菌体/ml；见注8）。 3.2.4制备E.coliSS320电穿孔法感受态 下述方案能产生大约12ml高浓度E.coliSS320电穿孔法感受态（约3X1011cfn/ml)。细胞可以长期储存于-70°C。 (1)在1ml的2YT/tet培养基中接种一个生长于新鲜LB/tet培养皿的E.coliSS320菌株单克隆。在200r/min摇床37°C孵育6~8h。 (2)转移培养液于有500ml的2YT/tet培养基的2L锥形瓶中，在200r/min摇动下37°C孵育过夜。 (3)用5ml上述过夜培养液接种6个2L锥形瓶，每瓶含有900ml的Superbroth/tet培养基（见12.2.1.4)。在200r/min摇动下37°C孵育到OD550约为0.8。 (4)在冰上冷却3个上述锥形瓶5min，不时摇动。下列步骤（5)~（12)应该在冷室中及冰上进行，所用一切溶液及仪器应该预冷。 (5)在SorvallGS-3转子中4°C及5000g(5500r/min)下离心10min。去除上清液然后从其他3个瓶中加入余下的培养液（所有液体需要预冷）。重复上述离心及去除上清液步骤。 (6)在离心瓶中加入1.0mmol/LHEPES，pH7.4，同时加入灭菌的磁铁搅拌棒来帮助重悬离心沉淀的细胞。摇动使沉淀脱离管壁，并且在适中的速度下磁力搅拌以完全重悬细胞沉淀。 (7)在SorvallGS-3转子中4°C及5000g(5500r/min)下离心10min。去除上清液，小心管中的磁铁搅拌棒。从转子中取出离心管时要小心保持离心管的位置以避免干扰管底的细胞沉淀。 (8)在离心瓶中加入1.0mmol/LHEPES，pH7.4。重悬细胞沉淀，重复步骤（6)和（7)中的重悬及离心过程。去除上清液。 (9)重悬每管细胞沉淀于150ml的10%超纯甘油中。不要混合各离心管。 (10)在SorvallGS-3转子中4°C及5000g(5500r/min)下离心15min。去除上清液并且取出磁铁搅拌棒。用一个移液管小心吸出残余的上清液。 (11)在一个离心管中加入3.0ml的10%超纯甘油，用（移液管）小心抽吸重悬细胞沉淀。转移悬浮好的细胞到另一个离心管，重复上述过程直到所有细胞沉淀都得到很好地悬浮。 (12)在液氮中快速冰冻分装为350μl的感受态细胞并且储存于-70°C。 3.3选择和分析能提高融合蛋白展示水平的P8变异体 3.3.1从hGH-P8库中选择噬菌体 将hGHbp包被于96孔Maxisorp免疫板上作为诱饵，上述hGH-P8库中的噬菌体通过多轮结合实验进行筛选[16]。在M13KO7辅助噬菌体的帮助下，噬菌体在XL-1Blue中进行增殖以备后续筛选之用。 1)用靶蛋白包被96孔Maxisorp板 (1)用100μl5μg/ml的靶蛋白（如hGHbp)溶液包被96孔Maxisorp板中的8孔，4°C孵育过夜。直接倾倒96孔板于水池，以去除孔中溶液。 (2)在每孔中加入200μl0.2%溶于PBS的BSA溶液以阻止其他蛋白质对Maxisorp板的非特异性结合，室温下摇动1h。 2)噬菌体库的选择 (1)在上述每孔中加入一定量的置于PBS-T-BSA缓冲液中的噬菌体库（约1012phage/ml)。在室温下摇动2h。然后用PBS-T缓冲液洗96孔Maxisorp板8次。结合筛选的严厉性（stringency)可以在以后的筛选中通过增加洗涤的次数来调控。 (2)在每孔中加入100μl的100mmol/LHCl以洗脱结合的噬菌体。在室温下强力摇动5min。 (3)将所有洗脱液收集到一起，加入1/5体积的1.0mol/LTris-碱中和。 3)增殖噬菌体以备后用 (1)将上述洗脱出的噬菌体混合液加入到10倍体积的XL-1Blue细胞中（OD550=0.5~1.0)。 (2)37℃下200r/min摇动孵育20min，取出10μl留备测量滴度，参考12.3.2.3节中步骤（4)。 (3)加入M13KO7helper噬菌体，在200r/min摇床37°C孵育45min。 (4)转移培养液于100ml的2YT/carb/kan培养基中，在200r/min，37°C下摇动过夜。 (5)利用PEG/NaCl沉淀法分离噬菌体，参照12.3.2.3节，步骤（8)~（10)。 (6)重复上述筛选过程5次，每轮只用一半的洗脱噬菌体。 3.3.2噬菌体酶联免疫法测定hGH展示水平 在hGH展示选择后（见12.3.3.1)，通过酶联免疫法[2，11]可以测定单个克隆的hGH相对于P8的展示水平。顺次稀释的hGH-P8噬菌体溶液在含固定化hGHbp诱饵的板上孵育。洗去未结合的噬菌体，结合的噬菌体经过辣根过氧化物酶偶联的M13抗体反应后可以通过光谱学进行检测。从噬菌体浓度对450nm吸收值曲线上，通过比较噬菌体浓度和特定吸收值关系，可以估计出P8变异体较野生型P8对hGH展示水平提高的程度[11]。hGH展示水平高的克隆被送去测定其DNA序列，进而推断出融合有hGH的P8变异体的序列。 (1)从新鲜的LB/tet板上挑出一个含有特定噬菌粒的E.coliXL-1Blue菌株的单克隆，放入1ml加有M13KO7helper噬菌体（1010pfu/ml)和50μg/ml羧苄青霉素（以保持噬菌体）及5μg/ml四环素（以保持F"附加体）的2YT培养基中。在200r/min，37°C下摇动2h，再加入25μg/ml的卡那霉素来选择共转染了M13KO7的克隆。再在200r/min，37°C下摇动6h，转移培养液于30ml2YT/carb/kan培养基中。在200r/min，37°C下摇动过夜。 (2)在4°C及27000g下（SorvallSS-34转子中，15000r/min)离心10min。转移上清液于一个含有1/5体积PEG/NaCl的干净试管中，室温孵育5min。在4°C及12000g下（10000r/min，SorvallSS-34转子中）离心10min。去除上清液。在2000g(4000r/min)简短离心一下，再用移液管吸走上清液残余。 (3)重悬噬菌体沉淀小团于0.5ml的PBS-T-BSA缓冲液中，将其转移到一个1.5ml的EP离心管中。在桌式离心机中用14000g离心5min，再转移上清液到一个新的1.5mlEP离心管中。 (4)利用分光光度计法估计噬菌体浓度。 (5)用PBS-T-BSA缓冲液准备5倍系列稀释的噬菌体储液。 (6)转移100μl的噬菌体溶液到有hGHbp包被且BSA封闭的96孔Maxisorp免疫板（见12.3.3.1中1))。温和摇动孵育1h。 (7)去除噬菌体溶液，用PBS-T缓冲液洗板8次。 (8)加入100μl的辣根过氧化物酶（horserADIshperoxidase)/抗M13抗体络合物(用PBS-T-BSA缓冲液稀释3000倍，见12.2.2.2)。温和摇动孵育30min。 (9)用PBS-T缓冲液洗8次，再用PBS洗2次。 (10)用100μl的TMB底物溶液显影96孔免疫板。用100μl的1.0mol/LH3PO4溶液终止反应，然后在96孔板读板仪中读出450nm的光吸收值。 |
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发布于 ： 2018-08-08
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