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| 实验方法原理 | 氯化锂沉淀法去除质粒制备物中小片段核酸（包括DNA和RNA)的原理是基于两种核酸在氯化锂溶液中的溶解度有所不同。氯化锂是强脱水剂，可降低RNA的溶解性(HearstandVinograd1961a,b），并剥离染色质上的蛋白质（Kondo1979)。因此，质粒粗提物中的高分子质量RNA和蛋白质可在高浓度氯化锂溶液中形成沉淀，从而可通过低速离心加以分离（实例请见Kondoetal.1991)。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | DNA样品 试剂、试剂盒 | 乙醇异丙醇LiCl乙酸钠TE 仪器、耗材 | SorvsllSS-34转子或性能相同的替代转子 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液和溶剂 乙醇，异丙醇，LiCl(4mol/L)，乙酸钠（3mol/L,pH5.2)，TE(pH8.0)，含有浓度为20μg/mlRNaseA的TE(pH8.0)。 2.核酸和寡核苷酸 DNA样品，CsCl密度梯度离心纯化。 3.离心机和转子 SorvsllSS-34转子或性能相同的替代转子 二、方法 1.测定质粒制备物体积，加入0.1体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2)和2倍体积的乙醇，置混合物于4℃30min。 2.于4℃以大于10000g(>9000r/min,用SorvsllSS-34转子)的转速离心15min回收核酸沉淀，尽可能多地倾去上清液。而后打开管盖置于工作台上数分钟以蒸发乙醇。 3.用含有RNaseA(浓度≥100μg/ml)的1mlTE(pH8.0)溶解湿的核酸沉淀。 4.加入3ml4mol/LLiCl溶液，置于冰上30min。 5.于4℃以12000g(10000r/min，用SorvsllSS-34转子）离心15min,从沉淀的核酸中分离DNA质粒。 6.将上清液转至一新的离心管，加入6ml异丙醇，室温放置30min以沉淀质粒DNA。 7.于4℃以12000g(10000r/min,用SorvsllSS-34转子）离心15min,回收沉淀的质粒DNA。 8.小心倾去上清液，加入5~10ml70%乙醇，简单振荡离心管，而后于4℃以12000g离心10min。 9.小心倾去上清液，打开管盖置于工作台上数分钟直至乙醇蒸发殆尽。 10.用TE(pH8.0)溶解湿的DNA沉淀。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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