gRNA慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5LTR开始，到元件3LTR结束。
慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子：一个是gRNA表达盒子，另外一个是Marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上，无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光／抗药性双marker供您选择。gRNA表达盒子则包括三部分序列：U6启动子、gRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上，每次构建载体，只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的gRNA打靶序列克隆到载体上即可。gRNA打靶序列与gRNAscaffold序列构成一个完整的gRNA。
1、克隆方法
赛业采用引物退火连接的克隆方法，将gRNA克隆到慢病毒骨架上。
我们的gRNA慢病毒载体使用了humanU6promoter转录gRNA。gRNA被Cas9蛋白识别，与基因组序列结合，从而引起Cas9蛋白对基因组序列的剪切。gRNA靶序列与目标基因DNA序列的匝配程度决定了gRNA的切割效率，而gRNA靶序列与其他目的基因DNA序列的匹配程度决定了gRNA的脱靶效应。gRNA靶序列的选择还遵循PAM序列的规则。我们建立了人的gRNA靶序列信息库，小鼠和大鼠的gRNA靶序列信息库也即将推出。您可以登陆www.vectorbuilder.com选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的gRNA进行载体设计。
CRISPR慢病毒系统
CRISPR慢病毒系统包括两个载体：
1)gRNA慢病毒载体
2)Cas9慢病毒载体
Cas9慢病毒载体利用CBh启动子共表达humanizedCas9基因和Hygromycin抗药性基因。gRNA慢病毒载体利用U6promoter表达gRNA，同时携带了一个表达抗药性基因的基因表达盒子。在设计gRNA慢病毒载体时，请选择非Hygromycin抗药性基因（Puromycin、Neomycin和Blasticidin），两个载体需要不同的抗药性基因配套使用才能起到药筛的效果。
2、质量控制
我们会对每一个gRNA慢病毒载体挑克隆，并测序gRNA片段。测序正确后，再进行酶切鉴定，酶切鉴定合格后交付。
赛业生物提供分子生物学技术服务：
基因调取：庞大的基因库，小鼠基因2万个，人类基因3万个，免费调取
载体构建：VectorBuilder高通量载体构建平台，2分钟完成在线载体设计
病毒包装：慢病毒包装、腺病毒包装、腺相关病毒包装
