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本人最近在对家族性遗传性高钙血症（FHH）的家族进行了多个可疑致病基因进行测序，测序公司已经给出了DNA的测序峰图及突变位点，但不知道这个突变是否是致病突变？还有如何才能知道该突变是否影响了氨基酸序列呢？本人在这方面零基础，麻烦稍微讲详细点，在这里先谢谢各位哥哥姐姐了，不胜感激！！！

用带GFP的干扰质粒转染细胞，转染后24小时看荧光，转染效约30%左右，然后消化铺板，铺板后30小时的样子加G418筛选，筛选到第5天看，可看到散在发荧光的细胞，但等到14天筛选完毕，克隆已形成，细胞看不到一点荧光，是怎么回事啊？我筛选出来的是不是真正的阳性克隆啊？请有经验的高手解答，多谢！

克隆英文 clone音译,简单讲种工诱导性繁殖式.克隆与性繁殖同.性繁殖指经雌雄两性殖细胞结合、由物体产代殖式,见孢殖、芽殖裂殖.由植物根、茎、叶等经压条、扦插或嫁接等式产新体叫性繁殖.绵羊、猴牛等物没工操作能进行性繁殖.科家工遗传操作、植物繁殖程叫克隆,门物技术叫克隆技术.
克隆技术设想由德胚胎家于1938首提 ,1952,科家首先用青蛙展克隆实验,断利用各种物进行克隆技术研究.由于该项技术几乎没取进展,研究工作80代初期度进入低谷. ,用哺乳物胚胎细胞进行克隆取功. 19967月5,英科家伊恩·维尔穆特博士用羊体细胞克隆产羊,给克隆技术研究带重突破,突破往能用胚胎细胞进行物克隆技术难 关,首实现用体细胞进行物克隆目标,实现更高意义物复制.研究克隆技术目标找更办改变家畜基构,培育群能够消费者提供能需要更食品或任何化物质物.
克隆基本程先含遗传物质供体细胞核移 植除细胞核卵细胞,利用微电流刺激等使两者融合体,促使新细胞裂繁殖发育胚胎,胚胎发育定程度（罗斯林研究所克隆羊采用间约 6）再植入物宫使物怀孕使产与提供细胞 者基相同物.程供体细胞进行基改造,性繁殖物代基发相同变化.培育功三代克隆鼠火奴鲁鲁技术与克隆利羊技术主要区别于克隆程遗传物质经培养液培养,直接用物理注入卵细胞.程采用化刺激代替电刺激重新卵细胞进行控制.19987月 5,本石川县畜产综合与近畿畜产研究室科家宣布,利用物体细胞克隆两牛犊诞.两克隆牛诞表明克隆物技术重复.
苏格兰罗斯林研究所1996利用克隆技术克隆羊利,立即誉本世纪重争论科技突破.突破带处显易见. 利用技术抢救珍奇濒危物、复制优良家畜体、 扩良种物群体、提高畜群遗传素质产性能、提供足量试验物、推进转基物研究、攻克遗传性疾病、研制 高水平新药、产供移植内脏器官等研究发挥作用.
肯定种技术面作用同,更程度表示种技术担忧,侨衔?绻?褂貌坏保?庵旨际蹩赡芏陨?肪巢?て诘牟涣加跋欤?恍┛蒲Ъ胰衔? 畜牧业量推广种性繁殖技术,能破坏态平衡,导致些疾病规模传播；其应用类自身繁殖,产巨伦理危机.
克隆羊莉身份披露,美俄勒冈科家证实于19968月已经利用克隆胚胎培育猴；传说,比利医已意克隆男孩.尽管比利科家否认克隆报道,各政府克隆技术律 伦理面能造影响非重视,美、德、、英、加 等纷纷立专家组研究问题,科家要求 领域研究加限制.世界卫组织总干事岛宏欧盟委员负责科研委员19973月11别发表声明 谈,表示反进行体克隆试验.目前各项技术较致看制定律加强种技术管理,并严禁用复制类.克隆羊利英科家维尔穆特说, 用克隆利种技术效率极低,功克隆利前该技术曾导致先缺损物.种技术用于类 非道.
政府十重视克隆技术及其提相关问题,家科委农业部等部门已召各面专家参加研讨、 座谈,并关问题达共识.专家认,物克隆技术功科研究重事件,既益面, 利能,必须采取措施加规范,严格控制住害面,使项技术造福于类.
199711月11,联合教科文组织第29届 巴黎通项题《世界类基组与权宣言》文件,明确反用克隆技术繁殖.文件指,应利用物、遗传医类基组研究面,, 咱研究必须维护改善公众健康状况目,违背 尊严作,用克隆技术繁殖作,能允许.
19981月12,欧洲19家巴黎签署项严格禁止克隆协议(european protocol on banning human cloning).际第禁止克隆 律文件,《欧洲物医条约》补充.项禁止克 隆协议规定,禁止各签约研究机构或使用任何技术创造与或死基相似,否则予重罚.违反协议研究员医禁止事研究行医,关研究 所或医院执照吊销.签约研究机构或欧洲外区进行类追究律责任.协议签字家、丹麦、立陶宛、芬兰、希腊、尔兰、意 利、拉脱维亚、卢森堡、摩尔瓦、挪威、葡萄牙、罗马尼 亚、斯洛文尼亚、西班牙、瑞典、马其顿、土耳其圣马力诺.
克隆技术发展
克隆,Clone译音,意性繁殖,克隆技术即性繁殖技术.前久报道英罗斯林研究所试验功克隆羊利,首利用体细胞克隆功,物工程史揭新页.
克隆技术已经历三发展期：
第期微物克隆,即由细菌复制千万模细菌变细菌群.
第二期物技术克隆,DNA克隆.
第三期物克隆,即由细胞克隆物.
自界,少植物具先克隆本能,番薯、马铃薯、玫瑰等插枝繁殖植物.物克隆技术,则经历由胚胎细胞体细胞发展程.早本世纪50代,美科家两栖物鱼类作研究象,首创细胞核移植技术,研究细胞发育化潜能问题,细胞质细胞核相互作用问题.1986英科家魏拉德森首胚胎细胞利用细胞核移植克隆羊,相继克隆牛、羊、鼠、兔、猴等物.我克隆技术颇,80代末,我克隆兔,1991西北农业发育研究所与江苏农院克隆羊功,1993科院发育物研究所与扬州农院共同克隆批山羊,1995华南师广西农合作克隆牛,接着农科院畜牧研究所于1996克隆牛获功.美近克隆猴取功,本科家声称繁殖200克隆牛.所述克隆物,都用胚胎细胞作供体细胞进行细胞核移植获功.
19972月英罗斯林研究所宣布克隆功羊利,用乳腺皮细胞作供体细胞进行细胞核移植,翻物克隆史崭新页,突破利用胚胎细胞进行核移植传统式,使克隆技术足进展.整克隆程：科家选取三母羊,先母羊卵细胞所遗传物质吸,另6岁母羊乳腺细胞与融合,形含新遗传物质卵细胞,并促使裂发育胚胎,胚胎定程度再植入第三母羊宫,由孕育并产克隆羊利.利酷像提供乳腺细胞6岁母羊. 羊利世界第利用体细胞克隆功物.克隆利功,理论说明高度化细胞,经定手段处理,复受精卵期合功能；说明发育程,细胞质异源细胞核发育调控作用.物遗传疾病治疗、优良品种培育扩群等提供重要途径,物种优化、濒危物种质保存,转基物扩群均定作用. 自克隆羊利功,世界各引起强烈反响,看作福音,则视祸水,笔者新技术应采取支持态度,物克隆取突破,处培养量品质优良家畜,丰富物质,使畜牧业本降低,效率提高,提供某些药物原料提高类免疫功能等等.羊利前,罗斯林研究所曾培育奶含治疗血友病药物原料转基羊,家公司50万英镑高价买.利用体细胞批复制羊,挽救更患者命.另外,利用克隆技术量复制珍稀物,挽救濒危物种,调节自态平衡,类造福,何忧患呢?,克隆技术能带负面影响,些克隆物遗传全等,种特定病毒或其疾病染,带灾难,计划克隆物,扰乱物种进化规律,干扰性别比例,种物界控制带许意想危害.要采取相应研究策,制订科克隆计划,种负效应避免.
至于克隆,没意义研究课题,代物史证明,克隆技术能复制外貌特征相同物,能克隆复制者原才能.思想才能受制约.所,即使能克隆酷似历史伟领袖、伟科家物,仅外貌相同,却缺乏伟领袖、伟科家思想、气质、才能,试问克隆具意义?至于主张克隆取体器官,用于医体器官移植,行.克隆首先公民,享权,克隆肯捐赠器官,发明者能侵犯权. 至于克隆,现实,克隆要存,首先要吃饭,要思维,没颅能,我总能培植植物吧?且,重要克隆符合世情情,今世界口急剧膨胀,少家已实行计划育,控制口增,种情况拆巨资做违背社发展规律事呢?德研究技术部吕特格斯所说：复制类允许,定发. 目前,克隆技术英新进展,技术应用于类造血事业.英PPL公司克隆技术经济台,主管罗思詹姆斯博士说：研究利我知道,我用细胞制造转基物.我现利用技术产类血液重要组部,血浆.与罗斯林研究所合作研究种带类基牛羊.先物体内血浆取,再取代类血浆,种改变基牛羊体内含类血浆重要,通些物饲养、再克隆或繁殖,稳定靠且相便宜血资源,据统计英每价值达150英镑.谓效益匪浅. 克隆技术前景估量.

肺癌见肺原发性恶性肿瘤
靶向药物目前先进用于治疗癌症药物靶向药物针肿瘤细胞特基发能够高度特异性识别杀灭肿瘤细胞具效、副作用较特点尤其适合体质较差肺癌患者
靶向治疗肺癌治疗前需要做基突变检查根据基情况决定否适合该种治疗肺癌基突变检查目前主要针
EGFR、KRASALK等靶标明确肿瘤药物敏性检查结助于相应靶向治疗药物选择药效异
基突变检查结阴性患者适合采用靶向治疗说明肺癌由基突变造能外界原所致辐射、防腐剂、免疫力低等等
基突变检查阴性肺癌患者没服用易瑞沙特罗凯必要且易瑞沙特罗凯目前际公认针非细胞性肺癌靶向药物没同类药物替代种情况应酌情考虑化疗

基突变特点5项:
1、普遍性：物界任何物都能发基突变细胞物任何细胞都能发基突变
2、随机性：基突变发物体发育任何期物体任何细胞突变发期越早表现突变部越突变发期越晚表现突变部越少若突变发于殖细胞例精卵细胞则能传递给代若发于体细胞则难传递给代
3、突变频率低：例真核物基突变频率约十万
4、般害利少物环境于原环境般适应则突变产新基应新性状般适应原环境故基突变般害
5、定项性：基突变显性突变隐性突变
论类型突变都具五特点

普遍发DNA复制期碱基配错
少量发任何期外界环境（辐射）损伤DNADNA自我修复修复能发突变

本人刚读研，试验小白，麻烦问各位大神，如果前期试验发现某基因在特种动物中发生了多处碱基突变，并且突变导致多处磷酸化位点和氧化域发生了改变。如果继续往下做，下游试验该怎么做？如何来分析这些突变位点对该基因表达的影响？**大神解答！感激不尽！

现在看来是一个很古老的话题似的，其实前年8月我写这篇文章的时候相关的文献都找不到几篇的。忽如一夜春风来，铺天盖地的RNAi文章出现。现在看来有点简单，但仍不失为我当年呕血之作。只是肿瘤发表周期太慢而已。
(题外话)
谨以此文献给可爱的小海豚，祝暑假在家，在海边玩儿得开心!
　　　　　　RNA干扰和肿瘤基因治疗
摘要：RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是指双链RNA诱导细胞内特定基因转录后沉默现象，它在肿瘤基因治疗中具有十分重要的作用。本文介绍了RNAi现象的发现、形成机理及其在肿瘤基因治疗中的应用现状及前景。
关键词：RNA干扰　肿瘤　基因治疗
Abstract：RNAinterferenceisaphenomenonthatds-RNAs(double-strandedRNA)inducespecificgeneposttranscriptionalsilencingincells.ItsuggeststhatRNAinterferencemayplayanimportantroleintumorgenetherapy.ThisarticleistointroducehowRNAinterferencewasfound,　formedaswellasitspotentialapplicationinthetumorgenetherapyfield.
Keywords：RNAinterference　　tumorgenetherapy
1RNAi现象的发现
1990年，来自美国的Napoli[1]和荷兰的Krol[2]分别报将外源性紫色色素合成基因查尔酮合酶（ChalconeSynthase，CHS）基因转入矮牵牛，试图产生出更深的紫色牵牛花，结果却发现花色素甙的合成发生了阻塞，大部分转基因植物开出了颜色斑驳或白色的花。检查白色花发现CHS基因mRNA的同步表达没有改变，而mRNA的转录比野生型减少50倍。导入基因和内源性基因均发生失活，这种现象被称为共抑制（co-suppression)。随后多个植物学家亦在不同转基因植物中发现类似现象。与此同时，意大利Macino[3]领导的实验室将外源性类胡萝卜素基因albino-3导入红色面包霉菌（Neurosporacrassa），发现约30%转化细胞的内源性的albino-3也受到了抑制，这种现象被他们称为静息作用（quelling）。
不仅植物和真菌如此，科学家们还在线虫发现类似的现象。1995年美国的Guo等[4]用反义RNA技术阻断线虫（CaenorhaBDitiselegans）par-1基因的表达以破坏线虫胚胎发育的对称性。结果发现不仅反义RNA能阻断par-1的表达，正义链RNA亦能抑制par-1的表达。他们将其称为RNA干扰。这种现象直到3年以后才得到解释。1998年Fire和Mello[5]公布了他们的实验结果，他们将少量双链RNA(dsRNA)注入线虫，发现内源性基因的mRNA发生特异性裂解。这种只需几分子外源dsRNA就能完全阻断特异内源基因表达的RNA干扰技术又被他们称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。紧接着这种现象在果蝇、拟南芥菜、水螅、涡虫、斑马鱼等较多真核生物中得到证实。
RNA干扰技术研究得最为广泛最为深入的是哺乳类动物。德国科学家Elbashir等[6]用核糖核酸酶III从长链dsRNA切取到21或22个核苷酸(nt)的小干扰RNA双倍体(smallinterferingRNAduplexes,siRNA)，将其转入不同的哺乳动物细胞系，能观察到内源性和外源性基因的特异性表达抑制。随后他们又用21-ntsiRNA成功特异性抑制哺乳动物细胞系的16个基因表达，并将这种技术和沉默基因敲除(knockoutofmurinegenes)技术进行比较，证实siRNA干扰技术能更准确、快捷地确定特定基因在生物发育和生长中的功能[7]。他们认为，21-ntsiRNA二倍体技术可能会在哺乳动物细胞基因功能的研究中发挥更大的作用，并有可能被用来进行特异性的基因治疗。荷兰科学家Brummelkamp等[8]则采用一种pSUPER质粒作为载体，这种载体带有一个H1-RNA启动子，克隆入载体的序列转录出来的RNA形成发卡状结构（smallhairpinRNAs，shRNAs)，在体内加工后形成类似siRNA分子，能引发基因沉默。这种载体对能够在瞬时转染和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达siRNA，引发更为持久的基因沉默。

国家自然科学基金资助项目，批准号30170961
*Tel:(020)61643265,Fax:(020)61643265,E-mail:zjxrx@163.net
2RNAi的形成机理
　　RNAi如何引发基因沉默？其形成机理目前尚不完全清楚。最初Hamilton等[9]发现在发生共抑制植物中发现一些约25个碱基的RNA，这些RNA与沉默基因的正义链和反义链互补，这为揭示RNAi机理提供了重要线索。接着Zamore等[10]发现外源性的dsRNA在果蝇细胞内被切割为约21-23碱基对的双链片段。随后一些与RNAi相关的酶被发现，其中最重要的是dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA-specificendonuclease,DICER)，推测该酶具有RNaseⅢ类核酶的性质。目前一般认为可能是dsRNA进入胞体内后可激活RNA核酸酶如DICER,在其作用下形成21-23碱基对的siRNA，siRNA解链或其它原因形成RNA诱导基因沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，这些RISC可专一性地与靶向的mRNA特异性结合，在RNA依赖性RNA多聚酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)作用下可形成新的dsRNA，新的dsRNA又被DICER识别而被切断形成siRNA，如此逐级放大式的作用形成大量新的siRNA，使RNAi作用在短时间内有效地抑制mRNA的表达[11]。而不少科学家设计的克隆入特定序列的载体转入靶细胞后能持续表达shRNAs，经修饰后形成siRNA，或者直接将siRNA注入靶细胞，作用原理基本一致。
3　RNAi在肿瘤基因治疗中的应用
目前认为RNAi是一种古老的自我防御的进化机制。它的主要作用是防御病毒感染和维持基因组中转座子的稳定。随着对RNAi机理的进一步研究，发现它是一种非常有用的研究工具。现已逐步用于研究基因的功能和了解生物的发育，它比在基因编码区加入选择性标记的基因敲除技术更优越。由于RNAi的技术操作的可行性和致基因沉默特性，已经有学者考虑将其引入肿瘤的基因治疗。
肿瘤基因治疗按其原理可常规性地分为细胞因子基因治疗、抑癌基因治疗、反义核酸治疗、自杀基因治疗、抗肿瘤血管生成治疗，而RNAi技术的提出只有短短5年时间，实验性应用于治疗肿瘤只有不到2年时间，但已取得不少令人振奋的结果。RNAi理论上有望成为一种新的肿瘤基因治疗方案。
德国学者Wilda等[12]在应用RNAi治疗白血病方面做出了有益的试尝。他们针对M-BCR/ABL基因设计出21-ntdsRNA，并将其转入白血病细胞系K562，通过实时PCR定量和westernblot检测，发现细胞中不能检测到M-BCR/ABLmRNA和M-BCR/ABL癌蛋白，还能观察到强烈的细胞凋亡现象。实验结果提示利用dsRNA转导能抑制内源性M-BCR/ABL基因mRNA表达，降低细胞恶性型，甚至导致细胞凋亡。随后日本学者Cioca等[13]报道他们设计针对c-raf和bcl-2基因的dsRNA转入髓样白血病细胞系HL-60、U937、THP-1和K562，发现转染后细胞系c-raf和bcl-2基因表达raf-1和bcl-2蛋白明显降低；针对c-raf基因的RNAi作用阻止TPA诱导单细胞分化出现；联合针对c-raf和bcl-2的RNAi能诱导HL-60、U937和THP-1细胞系的凋亡，并增强了其对依托泊甙和柔红霉素的敏感性。作者认为联合针对c-raf和bcl-2的RNAi能克服白血病瘤细胞对化疗药物的抵抗作用，可能为肿瘤治疗提供一条新途径。
种种迹象表明，用RNAi技术特异性抑制瘤细胞癌基因的表达能在肿瘤基因治疗中扮演重要作用，但怎样将dsRNA导入靶细胞则成为一个难题。显然采用短链dsRNA比长链dsRNA具有很大技术上的可行性，用细胞注射方式转入外源基因在临床基因治疗中是不合适的。Brummelkamp等[14]在构建pSUPER质粒载体的基础上，构建了带有H1-RNA启动子的逆转录病毒载体，设计针对K-RAS(V12)基因的小基因片段，克隆入载体后转至多种人癌细胞系，能持续表达siRNA，观察发现K-RAS(V12)基因被特异性抑制表达，肿瘤细胞恶性型明显降低。作者认为利用病毒载体导入siRNA用于肿瘤特异性基因治疗可抑制癌细胞的致瘤表型。
随着RNAi技术在肿瘤基因治疗中的试尝不断增多，有必要将其与其它基因治疗方法进行比较。日本学者Aoki等[15]将RNAi技术和反义核酸技术应用于人癌细胞系进行了比较。他们选取人肝癌细胞系和胰癌细胞系作为靶细胞，分别选取外源性的虫荧光素酶基因和内源性的c-raf基因作为靶基因，采用阳离子脂质体和一种他们研制的瘤细胞靶向性肽链作为载体，分别采用RNAi技术和反义核酸技术对靶基因进行干扰。结果提示RNAi技术比反义核酸技术能更有效地抑制人癌细胞系中靶基因的表达，作者认为RNAi技术可能成为一种更新、更有效的基因治疗途径。
RNAi技术可以采用长链dsRNA，也可以采用短链siRNA，还可以用带启动子的载体转入可以表达核内不均一RNA（heteronuclearRNA,hnRNA）的基因片段。hnRNA技术是指siRNA并非由外源dsRNA直接导入，而是利用带启动子的载体将能表达siRNA的基因导入细胞，在细胞内自行合成siRNA，从而发挥干扰作用。目前认为最持久、稳定沉默靶基因的办法就是hnRNA技术。然而怎样根据靶基因序列寻找最佳干扰位点并设计能转录出hnRNA的基因片段是一个新挑战。有报道只有不到50%的短序列能针对特异基因形成RISC，而只有不到10%能产生特异效果，一位澳大利亚学者Benitec的专利技术能找到针对人类特定基因的最佳干扰位点并设计出带启动子终止子的一段呈反向互补回文结构的DNA序列，利用载体转入靶细胞后即可转录出发卡状mRNA，发挥其干扰作用，其网址为http://www.benitec.com.au/gene-silencing.htm。美国著名RNA产品公司Ambion提供网上在线设计工具，可以用来更快、更有效地寻找最佳干扰位点，网址为http://www.ambion.com/techlib/misc/。目前一般认为，选取的21nt-RNAs应取自靶基因，其5’端应以AA开头，应用Blast到EST基因库搜索，确认靶向性基因是唯一的，siRNA序列GC含量最好在40-55%。
总之，随着人们对RNAi技术认识的更加深刻，RNAi技术将更广泛地用于肿瘤的治疗。将RNAi技术和其它基因治疗方法结合而设计针对肿瘤的治疗方案，将产生不可估量的潜力，必将探索出一条攻克恶性肿瘤的新路。
　
参考文献
1NapoliC,LemieuxC,JorgensenR.IntroductionofaChimericChalconeSynthaseGeneintoPetuniaResultsinReversIBLeCo-SuppressionofHomologousGenesintrans.PlantCell.1990;2(4):279-289
2vanderKrolA,MurL,BeldM,etal.Flavonoidgenesinpetunia:additionofalimitednumberofgenecopiesmayleadtoasuppressionofgeneexpression.PlantCell.1990;2(4):291-299
3RomanoN,MacinoG.Quelling:transientinactivationofgeneexpressioninNeurosporacrassabytransformationwithhomologoussequences.MolMicrobiol.1992;6(22):3343-3353
4GuoS,KemphuesK.par-1,agenerequiredforestablishingpolarityinC.elegansembryos,encodesaputativeSer/Thrkinasethatisasymmetricallydistributed.Cell.1995;81(4):611-620
5FireA,XuS,MontgomeryM,etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature.1998;391(6669):806-811
6ElbashirS,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001;411(6836):494-498
7HarborthJ,ElbashirS,BechertK,etal.IdentificationofessentialgenesinculturedmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs.JCellSci.2001;114(Pt24):4557-4565
8BrummelkampT,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.Science.2002;296(5567):550-553
9HamiltonA,BaulcombeD.AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants.Science.1999;286(5441):950-952
10ZamoreP,TuschlT,SharpP,etal.RNAi:double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell.2000;101(1):25-33
11SijenT,FleenorJ,SimmerF,etal.OntheroleofRNAamplificationindsRNA-triggeredgenesilencing.Cell.2001;107(4):465-476
12WildaM,FuchsU,WossmannW,etal.KillingofleukemiccellswithaBCR/ABLfusiongenebyRNAinterference(RNAi).Oncogene.2002;21(37):5716-5724
13CiocaD,AokiY,KiyosawaK.RNAinterferenceisafunctionalpathwaywiththerapeuticpotentialinhumanmyeloidleukemiacelllines.CancerGeneTher.2003;10(2):125-133
14BrummelkampT,BernardsR,AgamiR.StablesuppressionoftumOrigenicitybyvirus-mediatedRNAinterference.CancerCell.2002;2(3):243-247
15AokiY,CiocaD,OidairaH,etal.RNAinterferencemaybemorepotentthanantisenseRNAinhumancancercelllines.ClinExpPharmacolPhysiol.2003;30(1):96-102

大家好，最近做实验遇到了很棘手的问题：
克隆一个基因，构建好过表达质粒载体，稳定转染细胞，g418筛选稳定克隆，让其在细胞系中过表达，但westernblot显示大部分克隆基因的表达量下降，没有挑出稳定过表达的克隆；
接着做shRNA干扰，交给公司合成了四种shrna质粒，也是打算进行稳定转染，g418筛选，但先做了个瞬时转染预实验，转染换液后48小时收蛋白，westernblot鉴定，发现实验组都比对照高。
请问，有没有大神遇到过这种情况，如果有，可能的原因是什么，有没有解决的方法，有没有相关的文献支持？
谢谢，不胜感激！

基因突变是基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象（gene mutation）。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。

1个基因内部可以遗传的结构的改变。又称为点突变，通常可引起一定的表型变化。广义的突变包括染色体畸变。狭义的突变专指点突变。实际上畸变和点突变的界限并不明确，特别是微细的畸变更是如此。野生型基因通过突变成为突变型基因。突变型一词既指突变基因，也指具有这一突变基因的个体。
基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义。基因突变为遗传学研究提供突变型，为育种工作提供素材，所以它还有科学研究和生产上的实际意义。

种类

基因突变可以是自发的也可以是诱发的。自发产生的基因突变型和诱发产生的基因突变型之间没有本质上的不同，基因突变诱变剂的作用也只是提高了基因的突变率。

按照表型效应，突变型可以区分为形态突变型、生化突变型以及致死突变型等。这样的区分并不涉及突变的本质，而且也不严格。因为形态的突变和致死的突变必然有它们的生物化学基础，所以严格地讲一切突变型都是生物化学突变型。根据碱基变化的情况，基因突变一般可分为碱基置换突变（base substitution和移码突变（frameshift mutation）两大类。

碱基置换突变(subsititution)

指DNA分子中一个碱基对被另一个不同的碱基对取代所引起的突变，也称为点突变（point mutation）。点突变分转换和颠换两种形式。如果一种嘌呤被另一种嘌呤取代或一种嘧啶被另一种嘧啶取代则称为转换（transitioBU诱发的突变n）。嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤的突变则称为颠换（transversion）。由于DNA分子中有四种碱基，故可能出现4种转换和8种颠换。在自然发生的突变中，转换多于颠换。

碱基对的转换可由碱基类似物的掺入造成。例如，5-溴尿嘧啶(5-bromouracil，BU）是一种与胸腺嘧啶类似的化合物，具有酮式和烯醇式
两种结构，且两者可以互变，一般酮式较易变为烯醇式。当DNA复制时，酮式BU代替了T，使A-T碱基对变为A-BU；第二次复制时，烯醇式BU能和G配对，故出现G-BU碱基对；第三次复制时，G和C配对，从而出现
G-C碱基对，这样，原来的A-T碱基对就变成G-C碱基对。

碱基对的转换也可由一些化学诱变剂诱变所致。例如，亚硝酸类能使胞嘧啶（C）氧化脱氨变成尿嘧啶（U），在下一 次复制中，U不与G配对，而与A配对；复制结果C-G变为T-A（见右图）。又如，烷化剂中的芥子气和硫酸二乙酯可使G发生乙基化，成为烷基化鸟嘌呤（mG），结果，mG不与C配对，而与T配对，经过复制，G-C变为A-T。

移码突变（translocation）

指DNA片段中某一位点插入或丢失一个或几个（非3或3的倍数）碱基对时，造成插入或丢失位点以后的一系列编码顺序发生错位的一种突变。它可引起该位点以后的遗传信息都出现异常。发生了移码突变的基因在表达时可使组成多肽链的氨基酸序列发生改变，从而严重影响蛋白质或酶的结构与功能。吖啶类诱变剂如原黄素、吖黄素、吖啶橙等由于分子比较扁平，能插入到DNA分子的相邻碱基对之间。如在DNA复制前插入，会造成1个碱基对的插入；若在复制过程中插入，则会造成1个碱基对的缺失，两者的结果都引起移码突变。

缺失突变(deletion)

基因也可以因为较长片段的DNA的缺失而发生突变。缺失的范围如果包括两个基因，那么就好象两个基因同时发生突变，因此又称为多位点突变。由缺失造成的突变不会发生回复突变。所以严格地讲，缺失应属于染色体畸变。

插入突变(insertion)

一个基因的DNA中如果插入一段外来的DNA，那么它的结构便被破坏而导致突变。大肠杆菌的噬菌体Mu-1和一些插入顺序（IS）以及转座子（见转座因子）都是能够转移位置的遗传因子，当它们转移到某一基因中时，便使这一基因发生突变。许多转座子上带有抗药性基因，当它们转移到某一基因中时，一方面引起突变，另一方面使这一位置上出现一个抗药性基因。插入的DNA分子可以通过切离而失去，准确的切离可以使突变基因回复成为野生型基因。这一事件的出现频率并不由于诱变剂的处理而提高。

特性

不论是真核生物还是原核生物的突变，也不论是什么类型的突变，都具有随机性、低频性和可逆性等共同的特性。

普遍性

基因突变在自然界各物种中普遍存在。

随机性

T.H.摩尔根在饲养的许多红色复眼的果蝇中偶然发现了一只白色复眼的果蝇。这一事实说明基因突变的发生在时间上、在发生这一突变的个体上、在发生突变的基因上，都是随机的。以后在高等植物中所发现的无数突变都说明基因突变的随机性。在细菌中则情况远为复杂。在含有某一种药物的培养基中培养细菌时往往可以得到对于这一药物具有抗性的细菌，因此曾经认为细菌的抗药性的产生是药物引起的，是定向的适应而不是随机的突变。S.卢里亚和M.德尔布吕克在1943年首先用波动测验方法证明在大肠杆菌中的抗噬菌体细菌的出现和噬菌体的存在无关。J.莱德伯格等在1952年又用印影接种方法证实了这一论点。方法是把大量对于药物敏感的细菌涂在不含药物的培养基表面，把这上面生长起来的菌落用一块灭菌的丝绒作为接种工具印影接种到含有某种药物的培养基表面，使得两个培养皿上的菌落的位置都一一对应。根据后一培养基表面生长的个别菌落的位置，可以在前一培养皿上找到相对应的菌落。在许多情况下可以看到这些菌落具有抗药性。由于前一培养基是不含药的，因此这一实验结果非常直观地说明抗药性的出现不依赖于药物的存在，而是随机突变的结果，只不过是通过药物将它们检出而已。

稀有性

在第一个突变基因发现时，不是发现若干白色复眼果绳而是只发现一只，说明突变是极为稀有的，也就是说野生型基因以极低的突变率发生突变（一些有代表性的基因突变率见表）。在有性生殖的生物中，突变率用每一配子发生突变的概率，也就是用一定数目配子中的突变型配子数表示。在无性生殖的细菌中，突变率用每一细胞世代中每一细菌发生突变的概率，也就是用一定数目的细菌在分裂一次过程中发生突变的次数表示。据估计，在高等生物中，大约10^5~10^8个生殖细胞中，才会有1个生殖细胞发生基因突变。虽然基因突变的频率很低，但是当一个种群内有许多个体时，就有可能产生各种各样的随机突变，足以提供丰富的可遗传的变异。

可逆性

野生型基因经过突变成为突变型基因的过程称为正向突变。正向突变的稀有性说明野生型基因是一个比较稳定的结构。突变基因又可以通过突变而成为野生型基因，这一过程称为回复突变。从表中同样可以看到回复突变是难得发生的，说明突变基因也是一个比较稳定的结构。不过，正向突变率总是高于回复突变率，这是因为一个野生型基因内部的许多位置上的结构改变都可以导致基因突变，但是一个突变基因内部只有一个位置上的结构改变才能使它恢复原状。

少利多害性

一般基因突变会产生不利的影响，被淘汰或是死亡，但有极少数会使物种增强适应性。

不定向性

例如控制黑毛A基因可能突变为控制白毛的a+或控制绿毛的a-基因。

有益性

一般基因突变是有害的，但是有极为少数的是有益突变。例如一只鸟的嘴巴很短，突然突变变种后，嘴巴会变长，这样会容易捕捉食物或水。
解释了一个鸟的基因突变或进化后的明显区别

一般，基因突变后身体会发出抗体或其他修复体进
行自行修复。可是有一些突变是不可回转性的。突变可能导致立即死亡，也可以导致惨重后果，如器官无法正常运作，DNA严重受损，身体免疫力低下等。如果是
有益突变，可能会发生奇迹，如身体分泌中特殊变种细胞来保护器官，身体，或在一些没有受骨骼保护的部位长出骨骼。基因与DNA就像是每个人的身份证，可他
又是一个人的先知，因为它决定着身体的衰老、病变、死亡的时间。

独立性

某一基因位点的一个等位基因发生突变，不影响另一个等位基因，即等位基因中的两个基因不会同时发生突变。

①隐性突变：当代不表现，F2代表现。

②显性突变：当代表现，与原性状并存，形成镶嵌现象或嵌合体。

重演性

同一生物不同个体之间可以多次发生同样的突变。

按照表型效应突变型区形态突变型、化突变型及致死突变型等区并涉及突变本质且严格形态突变致死突变必物化基础所严格讲切突变型都物化突变型
1.形态突变：结构镰刀型细胞贫血症；体水平红眼突变白眼
2.化突变：镰刀型细胞贫血症血红蛋白结构突变原理
3.致死突变：比隐性纯合致死