【求助】提组织总RNA不用匀浆器只用液氮研磨行吗

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2021-07-20

问题描述：

同学都说提组织总RNA，不用匀浆器只用液氮研磨足够了，但为什么我的总是降解呢？

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wldy0208

用户

我是用组织提取RNA的，总体来讲，提RNA就怕降解，我是在夏天空调间做的，开始的时候有一批都不是很好，但是总的来讲，组织里的RNA量应该足够的。你提RNA的容器一定要灭RNA酶，我们的办法是包括离心管枪头等都用DEPC水浸泡至少半天，有的文献是1hs就可，然后放在也浸泡过的饭盒（铝质）中高压灭菌，做的时候要戴口罩，手套和帽子，因为有RNA酶的问题，我用匀浆器的处理组织，处理时同时加入1ml trizol，组织不要太大，像上面提的只要半粒绿豆大小约40mg就可（组织取材没有特别要求，我是取下后立即用生理盐水或PBS洗2遍，然后放入已DEPC处理的冻存管中直接浸入液氮，用时直接取出就可），整个过程都在冰上进行，以减少降解。下面是我提RNA的步骤。RNA的抽提：（1～6步骤放在冰上）总RNA最后保存在-80 oC中1.从组织标本置于匀浆器中，同时加入1mlTrizol匀浆并充分溶解。2.加入200ul氯仿，猛烈颠倒20次，充分混匀。放置5分钟。3.4oC、12000g离心15min。4.转移上清至1.5mlEP管中，加入异丙醇500ul混匀（上下颠倒几次，放置10分钟），沉淀2-3分钟后，4oC、12000g离心15min。5.弃去上清，加入600ul75％乙醇混匀；4oC、12000g离心5min～10min）。6.弃去上清，加无水乙醇800ul，混匀；4oC、12000g离心5min～10min）。7.弃去上清，干燥。加DEPC水溶解，定量并将RNA浓度调至0.5ug/ul。这样的RNA用DNA/RNA测定仪测定混合物的浓度和纯度，测定OD260/OD280值能在1.8～2.2之间，我的结果大部分在1.9左右。以上心得仅供参考。

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高枕无忧

用户

液氮研磨就足够了。降解是你中间什么步骤出了问题吧。比如：1.你的研钵在用之前要灭RNA酶，倒点酒精烧烧就可以了。2.淹没后及时转移，不要等样品融化了再转移。3.操作过程多换手套，少说话，呵呵，防止RNA酶污染。估计其他的你也都注意到了吧，小心操作就是。

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phoenix77

用户

用液氮研磨就足够了我们前段时间一直在提小鼠各个器官的RNA，提出来的效果都还不错在提的过程中我觉得应该注意几点：1、你的研体和研棒和小勺一定要灭RNA酶。如果不放心用锡箔纸包了高温干烤一下。2、样品在研磨过程中一定始终都要在液氮里，也就是说研磨过程中液氮不能干。希望对你有所帮助

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zhou8p1228

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磨的过程中要注意手套不要到处摸，最好一个就换个手套。

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xxboy

用户

该注意的都注意了，我只是想补充一点，但很关键：就是用液氮捻磨时，等到组织变成POWDER了（这个过程要及时或者一直保持组织在液氮中），就及时加trizol，然后立即补从液氮，慢慢磨，反复几次。就不用担心因研磨样品而降解组织的问题了！若有问题，就是你取组织的那一步没有把握好时间和操作。我一直都这样做，做表达谱芯片、小RNA表达谱芯片结果都不错！好运！

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72hours

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请问从细胞提取RNA需要匀浆或研磨吗？如果需要，请问应该注意什么？

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applepie118

用户

1。从细胞中提取RNA是不需要匀浆或是研磨的，其实离开本来生存的环境，不论是细胞还是组织都有可能降解RNA，所以其实要缩短研磨或是匀浆的时间，所以细胞是没有必要研磨的，组织研磨是因为单单靠TRIZOL来裂解他是没有办法是RNA完全释放的，因为组织不像细胞只是一层细胞壁而已有很多其他的物质影响RNA的释放2。我一般使用匀浆器，因为液氮操作起来比较危险，而且液氮要不断加入比较浪费时间，其实匀浆的关键是彻底才能避免杂质污染，最好匀浆后离心一次去除沉淀，恐怕和DEPC处理有关，大凡作RNA的人其实操作都很小心，最关键的就是样本质量以及DEPC处理的问题，只要注意这两点一般是可以得到很好结果的

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wldy0208

用户

细胞的提取RNA不要研磨的，只要用trizol就可，而组织的话我喜欢用匀浆器研磨都在冰上进行，同时trizol可以减少RNA的降解，经验就是组织千万不要太大，半粒绿豆大小就足够提取RNA了。

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shirlly

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我还想咨询一下，取样这个最前面的步骤需要注意哪些？比方说时间，取样点之类的有没有什么要求，我是学动物营养与饲料科学的

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shirlly

用户

上次帮师姐做过一批，RNA倒是有浓度可是恨低，不在允许的范围之内，采取的是匀浆方法，百思不得其解。请教。

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wldy0208

用户

我是用组织提取RNA的，总体来讲，提RNA就怕降解，我是在夏天空调间做的，开始的时候有一批都不是很好，但是总的来讲，组织里的RNA量应该足够的。你提RNA的容器一定要灭RNA酶，我们的办法是包括离心管枪头等都用DEPC水浸泡至少半天，有的文献是1hs就可，然后放在也浸泡过的饭盒（铝质）中高压灭菌，做的时候要戴口罩，手套和帽子，因为有RNA酶的问题，我用匀浆器的处理组织，处理时同时加入1mltrizol，组织不要太大，像上面提的只要半粒绿豆大小约40mg就可（组织取材没有特别要求，我是取下后立即用生理盐水或PBS洗2遍，然后放入已DEPC处理的冻存管中直接浸入液氮，用时直接取出就可），整个过程都在冰上进行，以减少降解。下面是我提RNA的步骤。RNA的抽提：（1～6步骤放在冰上）总RNA最后保存在-80oC中1.从组织标本置于匀浆器中，同时加入1mlTrizol匀浆并充分溶解。2.加入200ul氯仿，猛烈颠倒20次，充分混匀。放置5分钟。3.4oC、12000g离心15min。4.转移上清至1.5mlEP管中，加入异丙醇500ul混匀（上下颠倒几次，放置10分钟），沉淀2-3分钟后，4oC、12000g离心15min。5.弃去上清，加入600ul75％乙醇混匀；4oC、12000g离心5min～10min）。6.弃去上清，加无水乙醇800ul，混匀；4oC、12000g离心5min～10min）。7.弃去上清，干燥。加DEPC水溶解，定量并将RNA浓度调至0.5ug/ul。这样的RNA用DNA/RNA测定仪测定混合物的浓度和纯度，测定OD260/OD280值能在1.8～2.2之间，我的结果大部分在1.9左右。以上心得仅供参考。

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G37012042

用户

展开引用wldy0208我是用组织提取RNA的，总体来讲，提RNA就怕降解，我是在夏天空调间做的，开始的时候有一批都不是很好，但是总的来讲，组织里的RNA量应该足够的。你提RNA的容器一定要灭RNA酶，我们的办法是包括离心管枪头等都用DEPC水浸泡至少半天，有的文献是1hs就可，然后放在也浸泡过的饭盒（铝质）中高压灭菌，做的时候要戴口罩，手套和帽子，因为有RNA酶的问题，我用匀浆器的处理组织，处理时同时加入1mltrizol，组织不要太大，像上面提的只要半粒绿豆大小约40mg就可（组织取材没有特别要求，我是取下后立即用生理盐水或PBS洗2遍，然后放入已DEPC处理的冻存管中直接浸入液氮，用时直接取出就可），整个过程都在冰上进行，以减少降解。下面是我提RNA的步骤。RNA的抽提：（1～6步骤放在冰上）总RNA最后保存在-80oC中1.从组织标本置于匀浆器中，同时加入1mlTrizol匀浆并充分溶解。2.加入200ul氯仿，猛烈颠倒20次，充分混匀。放置5分钟。3.4oC、12000g离心15min。4.转移上清至1.5mlEP管中，加入异丙醇500ul混匀（上下颠倒几次，放置10分钟），沉淀2-3分钟后，4oC、12000g离心15min。5.弃去上清，加入600ul75％乙醇混匀；4oC、12000g离心5min～10min）。6.弃去上清，加无水乙醇800ul，混匀；4oC、12000g离心5min～10min）。7.弃去上清，干燥。加DEPC水溶解，定量并将RNA浓度调至0.5ug/ul。这样的RNA用DNA/RNA测定仪测定混合物的浓度和纯度，测定OD260/OD280值能在1.8～2.2之间，我的结果大部分在1.9左右。以上心得仅供参考。你好，这个RNA抽提的流程和提取细胞内RNA是一样的？可以用来提取组织里面的RNA吗......

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