QIAGENOneStepRT-PCRKit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。
Increasedspecificprimerannealing.AmmoniumandpotassiumcationsinQIAGENPCRBuffersincreasespecificityofprimerannealing.K+bindstothephosphategroups(P–)ontheDNAbackbone,stABIlizingtheannealingoftheprimerstothetemplate.NH4+,whichexistsbothastheammoniumionandasammoniaunderthermal-cyclingconditions,caninteractwiththehydrogenbondsbetweenthebases(B),destabilizingtheweakhydrogenbondsatmismatchedbases.Thecombinedeffectofthetwocationsmaintainsahighratioofspecific-to-nonspecificprimer-templatebindingoverawidetemperaturerange.
EfficientdetectionofviralRNA.A336bpfragmentofF-genemRNAwasreverse-transcribedandamplifiedfromSendaivirusRNAisolatedfrompersistentlyinfectedVerocells.ReactionswerepreparedusingtheQIAGENOneStepRT-PCRKitandtheindicatednumberofviralgenomecopies.M:Markers.(DatakindlyprovidedbyH.Rausch,MaxPlanckInstituteforBiochemistry,Martinsried,Germanyaspartoftheproject"Experimentalcontrolofvirologicalworkatsafetylevels2and3inBavaria,"supportedbytheBavarianMiNISTryoftheEnvironment.)
RT-PCRofGC-richtemplate.A439bpfragmentoftranscriptionfactorTAFII100mRNA(GCcontent:75%)wasreverse-transcribedandamplifiedfromHeLa-celltotalRNA.ReactionswerepreparedusingtheQIAGENOneStepRT-PCRKitwith(+)orwithout(–)Q-Solution.Q-SolutionensuresspecificamplificationofGC-richtemplates.M:markers.
HighlyspecificRT-PCRusinglowamountsoftemplate.One-stepRT-PCRwascarriedoutusingtheindicatedamountsoftotalRNAfromHeLacellsandprimersspecificfor-catenin,amplifyinga690bpproduct.Allreactionswerecarriedoutfollowingsuppliers"instructions.M:100bpladder.
Influenceofannealingtemperatureonspecificity.One-stepRT-PCRwasperformedusingkitsfromtheindicatedsuppliersoverarangeofannealingtemperatures.A1289bpfragmentfromthehumanRCC1genewasreversetranscribedandamplifiedfromHelaRNA(arrow).M:markers.HighlevelsofspecificamplificationwithoutoptimizationwereobservedonlywiththeQIAGENOneStepRT-PCRKit.TheQIAGENOneStepRT-PCRKitallowsfastandeasyRT-PCRsetup.Whatever theapplication —virusdetection,moleculardiagnosticsresearch,orgeneexpression analysis—justmixallcomponentstogetherinonetubeandstart thethermal-cyclerprogram.ThereactionmixturecontainsallofthereagentsrequiredforbothreversetranscriptionandPCR;nothingneedstobeaddedoncethereactionhasbeenstarted.
PerformanceQIAGENOneStepRT-PCRKit提供方便的规格，可使用RNA模板进行高灵敏度和特异性的RT-PCR。试剂盒中包含优化的组分，可在同一反应混合液中进行逆转录和PCR扩增，完成"一步式"反应。独特的酶组合和专门研发的反应缓冲液确保在一个管中进行高效、高特异性的逆转录和PCR，无需优化（参见"HighlyspecificRT-PCRusinglowamountsoftemplate"和"EfficientdetectionofviralRNA"）。试剂盒提供的新型的、双阳离子PCR缓冲液确保在宽退火温度范围内得到高产量的特异性PCR产物（参见"Influenceofannealingtemperatureonspecificity"）。使用Q-Solution可提高不理想的RT-PCR的表现，这种独特的辅助剂可帮助逆转录并高效扩增具有高GC含量和复杂二级结构的模板（参见"RT-PCRofGC-richtemplate"）。PrincipleQIAGENOneStepRT-PCRKit可对多种RNA模板进行简单、灵敏的一步式RT-PCR。
QIAGENOneStepRT-PCREnzymeMix含有为逆转录和PCR反应特别设计的酶。独特组合的Omniscript和Sensiscrip逆转录酶对RNA模板有高度亲和性，确保RNA逆转录的灵敏度达到1pg到2g。逆转录完成后，升温至95C，15分钟，活化HotStarTaqDNAPolymerase同时使逆转录酶失活。这种方法可减少引物二聚体等非特异性扩增产物的生成，并减少背景的影响，确保RT-PCR的高灵敏度和可重复性。
退火温度范围宽引物的最佳退火温度取决于碱基对的组成（如A、T、G、C核苷酸的比例）、引物的浓度和反应的离子环境。QIAGENPCRBuffers含有K+和NH4+，使用该缓冲液可在很宽的温度范围内增加特异性PCR产物的产量（参见"Increasedspecificprimerannealing"）。其原理是破坏非特异性结合的引物对，提供更加可靠的反应环境，减少繁琐的温度优化过程。相反，如使用仅含K+的PCR或一步式RT-PCR缓冲液，PCR最佳退火温度的范围较窄，可靠性较差。
QIAGENOneStepRT-PCRBuffer专为提高逆转录和PCR扩增的效率而设计。该缓冲液含有新型辅助剂，可防止逆转录酶对PCR扩增的抑制，而这是一步式RT-PCR中常见的问题。该缓冲液确保在较大的温度范围和Mg2+浓度范围内，引物与模板特异性结合，可对多种RNA模板进行高效的RT-PCR扩增。QIAGENOneStepRT-PCRKit含有Q-Solution，这是可修饰核酸熔解行为的新型辅助剂。Q-Solution可促进高GC含量或含较多二级结构的模板的逆转录和扩增。使用Q-Solution可简化复杂模板RT-PCR的优化过程。QIAGENOneStepRT-PCRKit含有您所需的所有试剂，可进行快速、简便的RT-PCR，用于多种灵敏的应用（见表）。
可靠的一步式RT-PCR结果QIAGENOneStepRT-PCRKit组分特点HotStarTaqDNAPolymerase高度特异性产物SensiscriptandOmniscriptReverseTranscriptasesRNA初始量的范围大(1pg2g)高灵敏度OneStepRT-PCRBuffer无需优化反转录酶不会抑制PCR抑制RNasesQ-Solution促进GC含量高的模板的扩增Procedure使用QIAGENOneStepRT-PCRKit可快速、简单的进行RT-PCR反应体系构建。无论是何种应用，即无论是病毒检测、分子诊断研究还是基因表达，您只需将所有试剂在一个离心管中混合即可开始PCR扩增（参见"OneStepRT-PCRprocedure"）。反应混合液含有逆转录和PCR反应所需的所有试剂，无需添加其他试剂即可开始反应（参见下表）。
ApplicationsQIAGENOneStepRT-PCRKit适用于RT-PCR分析，包括：
病毒检测单细胞RT-PCR基因表达分析
