取一定量的细胞悬液,先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,在加入荧光标记的第二抗体,生成抗原-抗体复合物,以流式细胞仪检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
一、不同来源样品的处理
1 . 培养细胞
(1)培养细胞用0.25%的胰酶消化。
(2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次,再用PBS或生理盐水悬浮细胞,加入预冷的无水乙醇,终浓度为60%——70% ,快速混匀,并用封口膜封口,置4℃下可保存15天左右。
2. 新鲜标本
(1)将标本切成1——2mm3的小块。
(2)PBS或生理盐水清洗后去除上清,加入0.2%胶原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10——30min(根据实验及不同组织确定),并不断振动。
(3)300目尼龙筛过滤,除去组织团块,PBS洗涤2次,300g离心5min,获得已消化的细胞。
3. 石蜡包埋标本
(1)标本在切片机上切取3——5片50μm厚的组织片。
(2)将切片彻底脱蜡,梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸馏水水化。
(3)0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30min,每隔10min振动1次。
(4)300目尼龙筛过滤,获得的细胞悬液PBS洗涤2次,300xg离心5min。
注意:脱蜡一定要完全(若加入100%乙醇无絮状物飘起即可);切片厚薄适宜,太薄碎片多,影响FCM分析结果,太厚易造成脱蜡不净;注意掌握消化时间,避免已释放的细胞被消化。
二、制备
1. 取1×106个细胞/100μl,先加入一抗混匀,置室温下避光反应30min。
2. 用PBS洗涤细胞2次,离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800——1000rpm,5min)。
3. 用100μl PBS重悬细胞,再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀,室温下反应30min。
4. 用PBS再洗涤细胞2次,加入500μl PBS重悬成单细胞悬液,上机检测。
1. 以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间,一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明,应先进行预实验,掌握好剂量与最佳反应时间后,再进行流式样品的制备。
2. 制备好的样品,若不能及时上机检测,用1%——4%的多聚甲醛固定,4℃下可保存5天。
此法由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。此外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。
您知悉并同意,丁香通平台展示产品并非为平台自身产品,您发起询价或试用申请后,平台将会把您已提供或按要求提供的相关信息同步提供至所咨询的具体产品商家,由商家为您提供具体产品的价格咨询或产品试用注意事项及相关试用产品或完成相应购买,因此您知悉并授权平台将您的信息进行同步共享。您有权拒绝,但您知悉将无法参加询价或试用活动。