提供商：	博仕生物医学服务中心
服务名称：	基因敲除

基因敲除（gene knock out） 基因敲除（gene knock out），是指对一个序列已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。  
平台基因敲除技术服务特点：
1．运用Recombineering技术以及LoxP与Frt序列的组合，实现利用一个基因打靶载体，同时完成报告基因小鼠、完全基因敲除小鼠、条件型基因敲除小鼠三种小鼠模型的构建
2 .对于重组效率特别低的位点，使用TALEN或者CRISPR/CAS9技术，增加了基因打靶载体的重组效率。
3 .使用来源于129/Ola品系的E14Tg2a小鼠ES细胞系，确保高效率的获得生殖系掺入的嵌合小鼠，同时使用来源于C57/BL6N品系的JM8A3小鼠ES细胞系，获得小鼠后无需回交，加快对小鼠的功能分析。
4. 利用talen或CRISPR/CAS9技术，进行小鼠受精卵的显微注射，完成对小鼠基因的快速完全敲除
5. 根据研究者的需要，对基因打靶策略提供个性化的设计。
基因敲除技术流程图：
第一步，胚泡时期发育胚胎的分离。此胚胎来源于灰色品系的小鼠。 
第二步，从灰色小鼠胚泡中分离胚胎干细胞，在体外进行培养。
第三步，用同源重组载体转染胚胎干细胞，用含有新霉素和更昔韦洛的培养基筛选发生了同源重组的细胞。
第四步，将筛选得到的胚胎干细胞植入白色小鼠的早期胚胎（胚泡时期）中。
第五步，将上述胚胎植入假孕母鼠（白色）子宫中。
第六步，在母鼠所产的小鼠中，有一些是正常的白色，另一些则是嵌合体灰白相间的小鼠。这些嵌合体小鼠的细胞一部分起源于白色皮毛的胚泡细胞，另一部分则起源于重组的胚胎干细胞。起源于重组胚胎干细胞的皮毛显示出灰色斑块，很好辨认。
第七步，嵌合体小鼠与野生型白色小鼠进行杂交，如果嵌合体小鼠的生殖细胞恰好是起源于重组胚胎干细胞，那么其子代小鼠就都应该呈现灰色。而这些灰色小鼠的所有细胞都是杂合体。
第八步，杂合体灰色小鼠（+/H）之间进行杂交，得到灰色和白色的子代。从灰色子代中筛选出纯合小鼠（H/H），其一对同源染色体上的等位基因都失活，此纯合小鼠即为 “基因敲除小鼠构建”。
 
 

 



 

技术方法：
（1）构建重组基因载体﹔ 
（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内﹔ 
（3）用选择培养基筛选已击中的细胞﹔ 
（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生   物学检测。 
技术平台优势：
依托于中科院上海巴斯德研究所的成熟胚胎实验技术，由留学美国加州大学旧金山分校的博士主持，经过3年的紧密筹备和院所内试运营，成功实现了基因打靶技术移植，我们已经建立了基因打靶载体构建，ES细胞培养，显微操作等技术系统，成功的为很多研究组制备了多种转基因与基因打靶小鼠品系。平台拥有一支技术精湛的研究队伍，在基因打靶载体设计与构建，ES细胞培养，以及胚胎显微操作等技术环节具有丰富的理论知识与实际操作经验，能为研究者提供专业的技术服务。
限量的技术服务合同，精品化服务，保证实验品质和进度：
一直以来，我们只服务于科学院系统内的科研课题组，由于系统日渐成熟，科研效率提高，产能过剩，我们适度开放，对外做一些市场化的活动（授权“博仕生物医学服务中心www.bio-serve.com做市场推广），我们崇尚的是精品化技术服务，限量的技术合同，保证实验任务的实施品质和按期完成。凡是与我们签订的技术服务合同，我们都经过精心合理的实验安排，保证实验进度；定期向客户汇报实验进程，让客户放心、安心，将基因敲除可能的技术风险降到最低。
 
高低搭配、合理运用新技术：
根据具体情况，在传统的同源重组的技术基础上，将最新的TALEN或CRISPR/CAS9技术合理应用到技术实施过程中，解决个别基因重组效率低的问题，保证实验的有效推进。
 
科学院的综合技术优势，表型分析、技术合作更顺畅
后期表型分析，集中中科院系统生化细胞所、神经所、营养所、健康所几大所的各个专业课题组的专业技术力量，为客户牵头引介，进行密切广泛的技术合作，将研究快速导向深入，提升科研水平。同时“博仕服务”的综合技术服务平台，能使下游表型鉴定实验的实施更便捷、高效。
 
服务内容：
提供“转基因”、“基因打靶”小鼠制备服务。具体内容包括：基因打靶载体构建、小鼠ES细胞转染、阳性ES细胞克隆筛选、囊胚显微注射、嵌合小鼠生殖系掺入鉴定等。
 
技术示例：



      小鼠ES细胞       ES细胞培养室         显微操作实验室 
      

                 平台获得的嵌合鼠
     
              具有生殖系掺入的F1子代小鼠
      




 
服务方提供：经过鉴定的基因敲除的小鼠及及每一步骤的实验证明数据。