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预实验:
- Cas9导入细胞方法:尝试各种方法,如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等,确定高效导入Cas9方法。
- 药物浓度预实验:降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。
- 单克隆培养情况:观察细胞是否可以单克隆培养。
基因敲除(敲入):
- 靶点设计
- 3个靶点,靶点位置尽量在基因CDS的前1/3,ATG之后,最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个,效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。
- 载体构建和病毒包装
- 内源活性筛选
- Donor载体(基因敲入)
- 单克隆筛选
- 获得突变型
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发布于 : 2021-08-17
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