E. coli Topoisomerase IV
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E. coli Topoisomerase IV
Topo IV (from Escherichia coli) is prepared by overexpressing the parC and parE subunits in E. coli and purifying them by methods adapted from Peng and Marians, 19991.
The parC and parE subunits are purified to >95% purity as judged by SDS-PAGE. The topo IV is supplied as a heterotetramer complex in Dilution buffer.
It is recommended that the enzyme is aliquoted to avoid repeated freeze-thaw cycles. Store at -80ºC.
All enzyme is supplied with 5X concentrated Assay Buffer and Dilution buffers which are also available separately.
See technical documents below for more detailed information and lot specific activities.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV Relaxation Assay Kits
These contain the enzyme and the supercoiled DNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for relaxation reactions. 1 U of topo IV will relax 0.5 µg supercoiled pBR322 DNA in 30 minutes at 37°C.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV DecatenationAssay Kits
These contain the enzyme and the catenated kDNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for decatenation reactions. 1 U of topo IV will decatenate 200 ng of kDNA when incubated in 1X Assay buffer in a total reaction volume of 30 µl at 37°C for 30 minutes.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV Assay Kits for Cell Extracts
These kits are designed for assaying cell extracts and partially purified fractions containing over-expressed topo IV and contain supercoiled DNA substrate, Assay buffer, Dilution buffer, control relaxed DNA and stop buffer/loading dye.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV Cleavage Assay Kits
These kits are designed specifically for cleavage reactions. They contain topo IV enzyme, supercoiled pBR322 DNA substrate and the Assay and Dilution buffers required for DNA cleavage reactions in addition to the enzyme and linearised pBR322 marker.
Cleavage specific enzyme available separately on request.
Technical Documents
E.coli Topoisomerase IV ATPase kits
These kits can be used to test the effects of potential ATPase inhibitors. For example, the coumarin drugs such as novobiocin inhibit the action of topoisomerase IV by competitively inhibiting the hydrolysis of ATP thus preventing supercoiling.
These assays are microtitre plate-based and thus large numbers of compounds can be screened in a relatively short period of time. They also continuous assays which can provide more information than an end point assay.
Technical Documents
High / Medium-Throughput Assay Kit - E. coli Topoisomerase IV
The kit is supplied with sufficient E. coli topo IV enzyme, plasmid DNA substrate, buffers and other assay components* for 100 assays. The enzyme is supplied at a concentration of 10 U/μl in Dilution Buffer. The kit is also supplied with sufficient wash buffers for one 96-well plate. These buffers are supplied as 20X concentrates and must be diluted with ultra pure water prior to use.
More information about this assay can be found on the "Services" page under "High/Medium Throughput Assay".
Kit issued with limited licence for individual use only.
Patent held by Inspiralis Ltd., Norwich, Norfolk, UK. (Patent No. GB0424953.8, US7838230)
Technical Documents
References
- Peng, H. and Marians, K.J. (1999) Overexpression and purification of bacterial topoisomerase IV, in DNA Topoisomerase Protocols Vol. I (Bjornsti, M-A., and Osheroff, N. eds.), Humana Press, Totowa, N.Jersey pp.163-169
- Maxwell, A., Burton, N.P. and O"Hagan, N. (2006) High-throughput assays for DNA gyrase and other topoisomerases. Nucleic Acid Res. 34 (15), e104
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ALT主要存在于肝细胞浆内,其胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死,就可以使血清酶增高一倍。因此,ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。但它并不具器官专一性,许多疾病都可以引起它的增高。明显升高见于急性病毒性肝炎,中度升高见于慢性肝炎、肝硬化活动期、肝癌、肝脓肿,心梗、心肌炎、心衰等也可轻度升高。因此对ALT升高的评价应密切结合临床。部分ALT升高与脂肪肝、饮用酒精有关。临床常用的保肝药物较多。但有些药物治疗效果可以但容易反复,致使一些肝脏疾病长期不能治愈,大量的肝细胞遭受破坏。如何保护肝细胞,是保护肝脏功能的关键所在。
转氨酶只不过是临床上常用的检查肝脏功能的一项指标,转氨酶的正常与否,并不能代表肝功能的好坏,转氨酶的高低也不是与肝脏功能状态呈比例的,转氨酶”水平的高低几乎不能反应肝脏的功能,转氨酶不过是肝细胞里面的一种成分而已,相比较而言这种成分在肝细胞中的含量比较高,肝细胞一旦遭到打击和破坏,转氨酶就被释放到了血液。而在这个时候,如果损害的肝脏细胞不多,肝脏完全能够正常工作
通常,体检中主要检查的转氨酶是丙氨酸转氨酶(ALT)。1%的肝脏细胞损害,
可以使血中ALT的浓度增加1倍。因此,ALT水平可以比较敏感地监测到肝脏是否受
到损害。
转氨酶水平在0—40之间是正常的。如果超出正常范围,医生会建议再查一次
,排除由于实验室设备故障和操作错误等因素造成误差的可能。如果转氨酶水平还
高,多半是由病毒性肝炎或其他肝病所致。但要确定是不是病毒性肝炎,还需要做
其他检查,结合病史、症状、体征等全面分析。
即使确认是病毒性肝炎,也不能简单地以ALT升高的程度来判断病情,因为对
于重型肝炎,可能由于存活的肝细胞比较少,释放到血液中的转氨酶很少,ALT反
而随病情的恶化而降低。
转氨酶高不都是肝炎
ALT的升高只表示肝脏可能受到了损害。除了肝炎,其他很多疾病都能引起转
氨酶增高。主要还有以下情况:
首先,人体内许多组织都含有转氨酶,比如心肌炎和心肌梗死都可能使天冬氨
酸转氨酶升高。
其次,如果有胆结石等胆道梗阻性疾病,可能因为淤胆而使血中转氨酶水平升
高。
此外,对于一些看起来没什么大病的人来说,还有可能因为长期酗酒导致酒精
肝,或饮食结构不合理导致脂肪肝,造成转氨酶高。
劳累也可能让转氨酶升高
对于健康人来说,转氨酶水平在正常范围内升高或降低,并不意味着肝脏出了
问题,因为转氨酶非常敏感,健康人在一天之内的不同时间检查,转氨酶水平都有
可能产生波动。
另外,健康人的转氨酶水平也有可能暂时超出正常范围。剧烈运动、过于劳累
或者近期吃过油腻食物,都可能使转氨酶暂时偏高。如果在检查转氨酶前一晚加班
工作,没睡好觉,或是体检前早餐时吃了油炸的东西,检查结果可能就会超出正常
范围。一个人刚刚在操场上跑了几圈,就立刻检查他的转氨酶水平,结果也可能会
高出正常范围。
如果是由于这些情况导致转氨酶升高,只要好好休息,过一段时间后再做检查
,就会发现转氨酶水平恢复正常了。
还有一种会造成转氨酶升高的情况是生病时吃了会损伤肝脏的药物,比如红霉素、四环素、安眠药、解热镇痛药、避孕药,还有半夏、槟榔、青黛等中药。在停用这些药物后,转氨酶水平会很快恢复正常。
总之,如果发现自己转氨酶高了,不要过于紧张,不要担心自己患了严重的肝脏疾病,但是也一定要给予足够的重视,好好休息,及时接受
正规复查和治疗。展开
Nutrition.2005Jul-Aug;21(7-8):838-47.
OBJECTIVE:Involvementoflipoxygenase(LOX)andcyclo-oxygenase(COX)oncellulardifferentiationorapoptosisinducedbybutyratehasbeenreportedrecently,buttheeffectontightjunction(TJ)permeabilityhasnotbeenreported.Onemajoractivityofbutyrateand,toalesserextent,propionateistomodulategenetranscriptionviahistoneacetylationbytheirhistonedeacetylaseinhibitoractivity.Inthisstudy,weevaluatedtheactivationofLOXandCOXinTJpermeabilitychangesbyshort-chainfattyacids,butyrate,propionate,andacetateinintestinalmonolayercellsandtheirpossIBLemechanismbyhistoneacetylation.METHODS:TheeffectsofLOXandCOXinhibitorsonTJpermeabilityandtheexpressionofLOXorCOXmRNAinducedbyshort-chainfattyacidswereinvestigatedinCaco-2cellsusingTranswellchambers.Theeffectsofhydroxyeicosatetraenoicacid(aproductofLOX)onTJpermeabilitywerealsoevaluated.Theeffectsofshort-chainfattyacidswerecomparedwiththoseoftrichostatinA(histonedeacetylaseinhibitor).RESULTS:ALOXinhibitorclearlyinhibitedtheeffectofbutyrateonTJpermeability,whereasCOXinhibitorsdidnot.TheLOXandCOXinhibitorspartlyinhibitedtheeffectsofpropionatebutnotofacetate.ButyrateincreasedLOXmRNAexpression,andhydroxyeicosatetraenoicacidandtrichostatinAmimickeditseffect.CONCLUSION:Theseresultssuggestthatshort-chainfattyacids,especiallybutyrate,induceTJpermeabilitychangesthroughLOXactivationthroughhistoneacetylation.
在肠腔,短链脂肪酸可以通过激活脂肪氧化酶的活性从而改变单层细胞间紧密连接的通透性
目的:最近,有文献报道了丁酸盐可以诱导细胞的分化或者凋亡,并且这种效应与脂肪氧化酶(LOX)以及环氧合酶(COX)有关,但是,关于丁酸盐对紧密连接的影响目前未见报道。人们已经知道,丁酸盐以及丙酸盐都可以通过他们对组蛋白去乙酰化酶的抑制作用从而引起组蛋白的乙酰化,并最终实现对基因转录的调控。在我们的研究中,我们研究了短链脂肪酸、丁酸盐、丙酸盐以及醋酸盐对肠上皮细胞间紧密连接通透性的影响,以及这种变化过程中LOX和COX的活化情况,并且研究了这些物质引起组蛋白乙酰化的可能机制。
方法:实验者利用Caco-2细胞以及Transwell小室建立肠腔的体外模型,研究了几种LOX、COX抑制物质对紧密连接通透性的影响,以及对LOX、COXmRNA水平的影响。同时,还研究了羟基二十碳四烯酸(这是一种LOX的催化产物)对TJ通透性的影响。在实验中,研究者还将几种短链脂肪酸的效应与曲古抑菌素A(一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂)的效应进行了比较。
结果:使用LOX抑制剂能够明显的抑制丁酸盐所引起的紧密连接通透性的增加,而COX抑制剂则没有这种作用。丁酸盐能够增加细胞中LOXmRNA的表达水平,而羟基二十碳四烯酸以及曲古抑菌素A也都有类似的作用。
结论:以上结果表明,短链脂肪酸,尤其是丁酸盐,能够通过对组蛋白的乙酰化作用活化LOX,并且导致肠上皮细胞间紧密连接通透性的增加。
不加磷酸化抑制剂也可以做磷酸化蛋白WB,但是有可能会影响具体的实验结果,大部分时候不加磷酸化抑制剂也能得到结果的。
需要注意蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应,所以取样品的过程要迅速,样品要新鲜。
所以做磷酸化蛋白WB,提取蛋白时不加磷酸酶抑制剂会有影响
Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。
中文名
荧光素酶报告基因
外文名
Luciferase
底 物
荧光素(luciferin)
生物荧光
bioluminescence
转录因子
反式作用因子
转录因子
行使调控基因表达的蛋白质分子
简介
Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
应用原理
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下:
(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒,如pGL3-basic等。
(2) 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
(3) 加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
技术流程
(1) 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。
(3)筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
(4) 扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照,提纯备用。
(5) 培养293(或其它目的细胞),并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)。
(6) 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
(7)提取蛋白并用于荧光素酶检测。
(8) 加入底物,测定荧光素酶的活性。
(9) 计算相对荧光强度,并与空载对照比较。
发展
双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时, 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供 PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们体会到该系统的便利。
体外分泌的荧光素基因:目前NEB公司提供新型的可在细胞外分泌的荧光素酶,分别是Gluc和Cluc,具体使用帮助可在NEB官方网站找到.展开
酶抑制剂新药发现的途径:一是来源于天然化合物,包括动植物和各种微生物等,二是化学合成物。在目前上市的药物中,以受体为作用靶点的药物占52%,以酶为靶点的药物占22%,以离子通道为靶点的药物占6%,以核酸为靶点的药物占3%。因此,酶抑制剂的开发是新药来源的一个主要途径。以酶为靶点开发新药存在巨大潜力,今后很长一段时间仍然是发现新药的重要着手点。