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...2.3.1 从果蝇胚胎中提取总 RNA 或 poIy(A) +RNA 实验方法 丁 ...
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试剂、试剂盒
实验步骤
一材料与设备

1)0.lmol/LNaOH

2)70%(V/V)乙醇

3)3mol/L乙酸钠,PH5.2

4)苯酚

5)无SDS的结合缓冲液:5mmol/LEDTA,10mmol/LTris-HCl(PH7.5)0.4mol/LNaCl

6)含SDS的结合缓冲液:0,5%(m/V)SDS,5mmol/LEDTA,10mmol/LTris-HCl(pH7.5),0.4mol/LNaCI。

7)TE缓冲液1Ommol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA.

8)SEVAG:氯仿:异戊醇(24:1)

9)漂白剂(Bleach):50%(V/V)家用漂白剂(HouseholdBleach)

10)含MgCl2的PBS(pH7.2):2.7mmol/LKCl,4.3mmol/LNa2HPO4,,1.8mmol/LKH2PO4,137mmol/LMaCl每升溶液加lgMgCl2

11)果蝇勻浆缓冲液:1%(m/L)SDS,0.15mol/L乙酸钠,高压灭菌并冷却到室温后加入PH8.0的Tris-HCl和EDTA至终浓度分别为50mmol/L,和5mmol/L


二操作方法

1.准备果蝇胚胎

(二)操作方法
1)收集胚胎,用双蒸水漂洗。

2)在50%漂白剂中去膜,然后用双蒸水漂洗。

3)把去膜的胚胎放在液氮中速冻。

4)样品可用于提取RNAt&可以冻存于-60℃

5)融化前将胚胎转移到50ml的管中.

2.总RNA的分离

1)在10ml酚和10ml果蝇勻浆缓冲液中勻浆30s,以平衡polytron匀浆器(以第七档)匀浆。

2)加入约3倍体积的果蝇匀浆缓冲液(如:.5ml胚胎加5ml缓冲液)及3倍体积的酚至冻存的胚胎中。

3)用polytron匀浆器以4.5挡匀浆3次,每次30s.勻浆液在液氮中速冻几秒至呈半固体。

4)用8OOml双蒸水洗涤匀浆器2〜3次。

5)加等体积的SEVAG至勻浆混合液中,振摇混合。

6)室温以5000g离心15min,分层

7)观察离心的溶液.①如果水相非常少而中间层起泡沫,则用宽吸口的吸头把中间层转移到50ml的管中,加入1.5倍体积的SEVAG,振摇混合后以12000g离心10min.保存水相继续下面的操作。②如果中间层只有很少泡沫或没有泡沫,则把水相转移到1.5倍体积的SEVAG中,振摇混合,以5000g离心lOmin。保存水相继续下面的操作。

8)继续用SEVAG柚提,至中间层没有泡沫。

9)在水相中,加入等体积的酚/SEVAG(1:1),按第7)步的方法抽提

10)继续以酚/SEVAG抽提,直至看不见屮间层。

11)用SEVAG抽提水相一两次,保存水相。

12)水相中加入0.1体积的3mol/L乙酸钠和2.5体积的无水乙醇。

13)颠倒混合,-80℃沉淀过夜。

14)于4°C,以14000g离心15min

15)去上清,室温干燥约2min

16)以适当体积的水溶解RNA沉淀u如果用下向的方法制Poly(A)+RNA,用含SDS的结合缓冲液溶解。

3.从总RNA中分离poly(A)+RNA

1)按产品说明书水合3型oligo(dT)纤维素。

2)用大量含SDS的结合缓冲液清冼纤维素。

3)按下列顺序漂洗柱子:10倍体积的0.lmol/LNa()H,10倍体积含SDS的结合缓冲液A倍体积的TE缓冲液,10倍体积含SDS的结合拳冲液

4)保存20ul总RNA(溶于含SDS的结合缓冲液中)于冰上,将剩余的总RNA上样到3型digo(dT)纤维素柱上。

5)收集洗脱液并fl过柱两次以上。

6)冼脱液于-80℃保存。

7)用10倍柱体积不含SDS的结合缓冲液洗柱

8)用6倍柱体积TE缓冲液洗脱poly(A)ˉRNA,在冰上收集洗脱液。

9)洗脱液中加0.1倍体积乙酸钠和2.5倍体积无水乙醇。

10)样品于80℃过夜。

11)于4℃,以14000g离心10min,去上清。

12)加入与上清等体积的70%乙醇漂洗沉淀。

13)于4℃.以14000g离心10min,弃上清。

14)用重蒸水溶解沉淀.分装成适当体积于-80℃或20℃保存



注意事项
1)纤维索的用量及柱的尺寸是很重要的,每1mg总RNA大约需lml纤维素树脂。

2)3型oiigo(dT)纤维素按下面的方法洗后可保存并可重新利用。先用10倍柱体积的0.lmol/LNaOH洗柱,再用10倍柱体积含SDS的结合缓冲液洗柱.装有含SDS结合缓冲液的纤维素柱密封后可于室温保存
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