RNA放射性标记
| 实验材料 | [α32P]UTP或CTP(800Ciml10mCiml)UTP或CTPT4多核苷酸激酶(γ32P)ATP牛小肠磷酸酶T4RNA连接酶[32P]pCpATP2OumolL无tRNA酶的牛血清白蛋白 试剂、试剂盒 | 10XT4多核苷酸激酶缓冲液DEPC处理的水10X磷酸酶缓冲液TE(pH7.4)5molLNaClTE(pH7.6)10XT4RNA连接酶缓冲液DMSO
实验步骤 | 一材料与设备 1)[α32P]UTP或CTP(800Ci/ml,10mCi/ml)。 2)UTP或CTP。 3)T4多核苷酸激酶 4)10XT4多核苷酸激酶缓冲液 5)(γ32P)ATP(3000Ci/mmol；10mCi/ml) 6)牛小肠磷酸酶 7)DEPC处理的水 8)10X磷酸酶缓冲液 9)TE(pH7.4) 10)5mol/LNaCl 11)TE(pH7.6) 12)T4RNA连接酶 13)[32P]pCp(3000Ci/mmol；lOmCi/ml) 14)10XT4RNA连接酶缓冲液 15)DMSO 16)ATP，20umol/L。 17无tRNA酶的牛血清白蛋白 二、操作方法 (一）RNA内部标记 1)在体外转录体系中加入5ul[α32P]UTP或CTP(800Ci/ml，10mci/ml），不加未标记的UTP或CTP或限制它们的浓度为10〜15umol/L,孵育时间最长为1h 2)DNase消化后，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳RNA,纯化标记的全长RNA。 (二）5＇端标记RNA 逋过T4多核苷酸激酶在5＇端标记RNA。这个酶将[32P]由[γ-32P]ATP上转移到分子的5＇端.伹5＇端标记的RNA分子需要先用牛小肠磷酸酶去除非同位素的5＇磷酸。 1)用DEPC处理的水稀释1〜2ugRNA至终体积为16ul,95℃下放置2min后，冰浴5min,变性RNA 2)加入2ul10X磷酸酶反应缓冲液，2ul牛小肠磷酸酶(1U/ul);37℃反应30min 3)用TE(pH7.4)稀释RNA至终体积为200ul,加6ul5mol/LNaCl如前所述沉淀RNA。 4)用TE(pH7.6)重悬RNA至RNA浓度为0.5ug/ul。取2ulRNA溶液，95℃放置2min后，冰浴5min 5)加10XT4多核苷酸激酶缓冲液4ul[γ32P]ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml),iyT4多核苷酸激酶(3〜6U/ul)，于37°C孵育30min 6)用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的RNA (三）3＇端标记RNA 利用T4RNA连接酶和过量的[32P]p4以标记RNA的3＇端 1)将1〜2ugRNA于68℃放置2min后，冰浴5min,使之变性 2)加入4ul10XT4RNA连接酶缓冲液，4ulDMSO，1ul20umol/LATP,1ull0ug/ml无RNA酶的牛血清白蛋白，1〜2ugRNA,5〜10ul[32P]pCp(3000Ci/mmol,lOmCi/ml)，用DEPC处理水补足总体积40ul。4°C孵育过夜。 3)用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的RNA。 免责声明 本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容。
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发布于 ： 2018-08-05
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