新鲜血液能直接离心吗
实验材料 | L-多聚赖氨酸I型胶原蛋白酶HBSSDMEMFBSDMEMBS单克隆抗体第二抗体Sprague-Dawley大鼠 试剂、试剂盒 | LeibowitzL-15培养液70%乙醇 仪器、耗材 | 培养瓶培养皿盖玻片Petri培养皿15ml带盖聚丙烯锥形管7号弯镊和直镊带盖圆底聚苯乙稀管弯解剖剪手术刀切除用的板和针荧光激活细胞分选仪 实验步骤 | 准备分离的OEC悬液 1.通过断头处死大鼠(Sprague-Dawley大鼠:生后6~8d。尽管能够从任何年龄大鼠分离OEC,但是从新生大鼠获得的OEC比年龄大的大鼠多)。用15~20只大鼠取细胞,FACS(荧光激活细胞分选仪(FACS;B-DBiosciences)分选这些细胞需2~3h,分选得到的OEC足以覆盖10~15张盖玻片,每张盖玻片10000个细胞。 培养瓶、培养皿和盖玻片:用13.3mg/mlL-多聚赖氨酸预涂 (a)孵育1~24h; (b)用D-PBSA洗一下; (c)使用前晾干。 2.将头背侧部分定于切除板上,用70%乙醇喷洒头部。 3.使用前将全部器械用70%乙醇浸泡,然后摇晃器械,使其变干。 4.用尖弯剪除去皮肤,然后作环形切口,除去颅盖,在鼻尖处显露脑和两个嗅球。 5.用弯镊从脑轻轻取下嗅球,放入有一滴L-15(含有庆大霉素)的Petri培养皿。 6.用无菌手术刀片将嗅球切成小块。 7.将嗅球小块放入含有1ml胶原蛋白酶储藏液和1mlL-15的小瓶中。 8.在37°C条件下,孵育嗅球小块30~45min。 9.将悬液离心(1000r/min,5min),然后吸去上清液。 10.用1ml不含Ca2+和Mg2+的HBSS混悬嗅球组织。 11.神经胶质细胞易受损伤。因此,须轻轻分散嗅球组织,以形成单细胞悬液,注意不要产生气泡。通过19G皮下注射针分散嗅球组织,然后通过23G皮下注射针分散。 12.加入5ml不含Ca2+和Mg2+的HBSS,将悬液离心(1000r/min,10min)。然后,吸去上清液,用DMEM-FBS(DMEM(Gibco),添加5%FBS)混悬细胞,细胞浓度为5×106个/ml。 用FACS分选OFC 为了尽吋能从被分选的细胞中除去较多的O4+少突胶质细胞,最好用半乳糖脑苷脂的第二抗体(抗鼠IgM-荧光素和抗小鼠IgG3-藻红蛋白(SouthernBiotechnologyAssociates或CambridgeBiosciences))(anti-GalC)[Ranschtetal.,1982;Barnettetal.,1993]标记细胞,以辨別少突胶质细胞和OEC。在这方面,可进行双色分选,用两种抗体标记的不需要的细胞可忽略。用FACSVamage分选1h。 13.分散组织后,将5×106个细胞放入15ml离心管,用500μlO4和ami-GalC抗体杂交瘤上清液的混合液混悬细胞,在4°C条件下孵育30~45min。细胞总数将超过5×106个,故应准备足够的离心管。如果杂交瘤上清液不含有高浓度抗体,增加细胞数将导致O4+细胞的百分比明显降低。类似分析也用于anti-GalC杂交瘤上清液。因此,使用前常需要通过FACS分析滴定抗体。 14.用DMEM-FBS将细胞洗2次后,再用500μl含有羊抗小鼠IgM-荧光素(1:100)和羊抗小鼠 IgG3-藻红蛋白(1:100)的DMEM-FCS混悬,在4°C条件下孵育30min。 15.通过离心,用15mlDMEM-FBS将细胞洗2次。然后,用冰冷的DMEMFBS(DMEM(GIBCO),添加下列成分(Bottenstein和Sato,1979):25mmol/L(4.5g/L)葡萄糖、25μg/ml庆大霉素(Invitrogen)、0.0286%(V/V)BSApathocyte(MPBiomedicals)、2mmol/L谷氨酸胺、10μg/ml牛膜岛素、100μg/ml人转铁蛋白、0.2μmol/L孕酮、0.10μmol/LL-腐胺、0.45μmol/LL-甲状腺素、0.224μmol/L硒和0.49μmol/L3,3,5-L-三碘甲状腺原氨酸。除庆大霉素和BSApathocyte外,其余试剂都是Sigma公司生产的)混悬分选管(2085,BDBiosciences)内的细胞,密度为2×106个/ml。将分选管放在冰上。当细胞放在冰上时,抗体标记细胞的FACS图像至少3~4h内是稳定的。 16.本操作步骤叙述FACSTar细胞分选仪分选细胞的方法。然而,任何种类的细胞分选器应产生类似的结果。使激光排列成488nm激发光线。须设定荧光补偿,以除去每种荧光源中的过剩荧光。在分选单独用第二抗体标记的细胞之前,应分析对照细胞,以便于解释非特异性标记和通过减少光倍增管的增益除去非特异性荧光。 17.将细胞分选窗设置在O4+GalC-附近。O4+嗅球细胞的平均百分比应为10%±1%。 18.将O4+GalC-细胞分选入含有4mlDMEM-FBS的圆底聚苯乙烯筲。 19.分选后,将分选的细胞移入15ml离心管。用培养液清洗分选管,将清洗液加入离心管,然后加入DMEM-FBS。离心(100g,15min)。 20.吸去上清液,用DMEM/BS混悬细胞。用DMEM/BS:ACM(1:1)稀释时,可获得理想的OEC活力和生长[Barnettetal.,1993]。ACM是用DMEM/BS培养48h后从纯化的皮质星形胶质细胞单层[NobleandMurrey,1984]收集的。 |
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发布于 : 2018-08-10
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