阶段1:pTet-tTAK稳定转染成纤维细胞

材料

缓冲液和溶液
贮存液稀释到适当浓度。

CaCl₂(2mol/L)
溶液过滤除菌，然后以毎份5ml分装，贮存在-20°C。

小牛血清（10%)

氯喹（10mg/ml)
可选，请见步骤7。
氯喹溶于水，溶液过滤除然后贮存在-20°C。
10mg/ml氯喹相当于19mmol/L。请见第16章信息栏的二磷酸氯喹部分。

甘油（15%)HEPES缓冲液稀释

HEPES缓冲液

磷酸缓冲液

酶和缓冲液

合适的限制性内切酶
请见步骤2。

1X胰酶-EDTA
0.05%胰酶
0.5mmol/LEDTA(PH8.0)

培养液

DMEM完全培养液（Dulbecco"smodifiedEagle"smediumcomplete)
DMEM
100单位/ml靑霉素
100ug/ml链霉素
2mmol/L谷氨酰胺
10%供体小牛血淸

含有0.5吨/ml四环素-HCl的DMEM完全培养液
四环素-HCl溶于70%乙醇，浓度10mg/ml,贮存于-20°C。本方案中使用的含有0.5ug/ml四环素-HCl的DMEM完全培养液(含有或不含有选择性试剂）在4°C可以避光保存太约1个月。

含有L-组氨醇（L-histidind)和0.5ug/ml四环素的选择培养液
不含组氨酸的DMEM
100单位/ml青霉素
100ug/ml链霉素
2mmol/L谷氧酰胺
10%供体小牛血清
125,250或500umol/LL-组氨醇（准备125mmol/L贮液，在-20°C贮存)
0.5ug/ml四环素-HCl(溶于70%乙醇，浓度10mg/ml,在-20°C贮存）
IrvineScientific公司（SantaAna,California)出售不含组氨酸的DMEM。含有0.5ug/ml四环素-HCl的选择培养液在4°C可以进光保存大约1个月。

特殊设备

塑料克隆环
克隆环竖放在一薄层真空脂上高压灭菌。

聚丙乙烯管（4ml)

组织培养皿（6cm和10cm)
这些方案可以缩小规模，那样需要的细胞少，使用的培养皿和培养板部小一些，并且所有组分按比例减少。

附加试剂

步骤23需要列在第7章方案8或附录8中的试剂。

载体和菌株

pSV2-His
质粒都用CaCl-溴化乙锭梯度平衡离心（第1章方案10）或层析柱纯化（第1章方案9）。
关于pSV2-Hia的信息，请见Damke等（1995)。质粒pTet-tTAk和pTet-Splice在LifeTechnologies公司有售，其他带有选择标记的载体也有出售（如Promege公司有pCI-neo，CLONTECH公司有pTK.HYG)。如果以其他载体代替pSV2-His，要用适合该质粒所带选择标记的选择培养液。

带有靶基因开放阅读框的pTet-Splice
可选，请见步骤2。

pTet-tTAk

细胞和组织

培养的哺乳动物细胞
本方案使用NIH-3T3细胞，但其他细胞当然也能用。细胞在合适的培养液中生长。

方法

培养和转染细胞

1.在DMEM完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有0.5ug/ml四环素-HCl(四环素）的DMEM完全培养液中。每个10cm培养皿中加入足量细胞,使转染那天，细胞可以有33%的汇合度。
重要：从这时起除非特别说明，细胞都在37°C，5%CO₂，含有0.5ug/ml四环素-HCl的培养液中培养。

2.在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每种质粒的浓度调整为≥0.5mg/ml。10~20ug质粒pTet-tTAk和1~2ugpSV2-His(Tet质粒与带选择标记的质粒的摩尔比大约为10:1)与500ulHEPES缓冲液在一个干净的4ml聚丙乙烯管中混合。
如果要共转染靶基因，那么带有靶基因的pTet-Splice重组体的加入量与pTet-tTAk的摩尔数相等。


3.DNA混合物中加人32.5ul2mol/LCaCl2。立即轻轻振荡使溶液混匀。溶液在室温保存，不时地混匀。15~30min后会形成絮状沉淀。
用磷酸钙转染细胞的更详细内容请见第16章方案2和3。

4.吸掉步骤1准备的细胞培养皿中的所有培养液。

5.用巴斯德吸管混合CaCl₂-DNA若干次。滴加混合物，使它均匀地盖在单层细胞上。

6.细胞在37°C，5%CO₂条件下培养30min,15min后摇动培养皿，保证DNA沉淀物的均匀覆盖。

7.每个细胞培养皿中加入10ml含有四环素的DMEM完全培养液。细胞在37°C，5%CO₂条件下培养4~5h。
如果细抱可以耐受，这时可以加入终浓度为25umol/L的不同类型细胞的最佳转染培养时间会有变化。

8.轻轻吸掉培养液。避免破坏细胞上的沉淀物。

9.加2.5ml含15%甘油而且预热到37°C的HEPES缓冲液进行甘油休克。细胞在室温放置2.5min。甘油是滴加到培养液中。
甘油休克后，细胞看上去有些碎碎的是正常的。使用氯喹（步骤7)会进一步减低细胞的完整程度，但会提高转染效率。

10.恰好在2.5min的时候吸掉甘油溶液。操作得快一点，因为甘油对细胞毒性很大。
对于某些恢复能力强的细胞类型，为了优化转染效率，细胞在甘油溶液中的时间可以提高到4~5min。
作为一般规則，细胞休克的最长时间应该允许有大约50%的细胞存活。

11.立即又轻又快地加入10ml含有四环素的DMEM完全培养液洗细胞。立即吸掉培养液，再重复洗涤。
重要：因为甘油休充后，细胞很容易从培养皿上脱落下来，所以培养液都要在一个位置加。

12.细胞中加入10ml含有四环素的DMEM完全培养液，37°C培养过夜。

13.转染后大约16~24h,吸掉培养液，换上10ml含有四环素的DMEM完全培养液。
转染后一共在37°C培养48h(即步骤12和13的总培养时间）。

转染细胞的筛选和克隆

14.转染后48h,细胞用几种稀释度分到含有125umol/L组氨醇和0.5ug/ml四环素-HCl的培养液中。细胞密度为每个10cm培养皿大约1X10⁶到3X10⁴。含有大约1X10⁵细胞的培养皿需要培养若干个。

15.细胞在选择培养液中培养4天后，接着用3~4ml含有125umol/L组氨醇和0.5ug/ml四环素-HCl的选择培养液培养。

16.集落形成后（通常经过大约10~12天选择培养)，换成含有250umol/LL-组氨醇和0.5ug/ml四环素-HCl的选择培养液。
L-组氨醇通常对细胞有毒。所以只有当pSV2-His有高水平表达的细胞量达到曲界值，才能提髙选择培养液中L-组氨醇浓度

17.集落长好以后（选择培养12~15天)，在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿中挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。
重要:用pTet-tTAk稳定转染后，为了防止tTA表达及随后筛选髙表达tTA的克隆时的毒性作用，细胞必须在含有0.5ug/ml四环素的培养液中培养。

18.用大约100ul磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加2滴1X胰酶-EDTA(~100ul)并放置30~60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到24孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有1ml含250umol/LL组氨醇和四环素的选择培养液。
随后的细胞传代都用标准方法，如（1）PBS快速洗涤；（2）1~3min胰酶-EDTA消化（毎个铺满细胞的10cm培养皿加2ml);（3）用含四环素的选择培养液或10%小牛血淸稀释/终止胰酶的活性。

19.当孔中的细胞长到80%汇合度，把它们转移到6cm组织培养皿中，用含有500umol/LL-组氨醇和四环素的选择培养液培养。
NIH-3T3细胞可以在大约4~7天生长到80%汇合度；但是不同细胞系甚至不同克隆生长到80%汇合度所需的时间是不同的。

20.细胞在含有500umol/LL-组氨醇和四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行1:5到1:10稀释）。

细胞进行蛋白诱导表达测试

21.当单层细胞再次生长到大约80%汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试蛋白的诱导表达。
以后使用冻存细胞的时候,需要复苏，然后在含有500umol/LL-组氨醇和0.5ug/ml四环素-HCl但不含组氨酸的DMEM培养液中培养。

22.如果细胞用tTA和靶质粒共转染，可以如阶段3所述直接分析靶基因的产物。如果细胞只用pTet-tTAk质粒转染，如下进行细胞的诱导表达测试：

a.诱导前一天，细胞以适当的密度在含有500umol/LL-组氨醇和0.5ug/ml四环素-HCl的DMEM培养液中培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。

b.第二天，用PBS洗细胞3次，每次都要轻轻旋转培养板。

c.第三次洗涤后，立即加入含有500umol/LL-组氨醇但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养6~48h。


23.通过Northern分析或免疫印迹法测试细胞中tTA的诱导表达。然后如阶段2所述，用靶质粒转染表达tTA的细胞系。
稳定转染的NIH-3T3细胞中，通常诱导6h后可以观察到tTA和靶基因的表达，再过6h后，表达量达到最大值。


阶段2:四环素调控的靶基因稳定转染可诱导表达tTA的NIH-3T3细胞

材料

缓冲液和溶液

小牛血清（10%)

HEPES缓冲液

磷酸缓冲液

酶和缓冲液

合适的限制性内切酶

1X胰酶-EDTA
0.05%胰酶
0.5mmol/LEDTA(pH8.0)

培养液
含有500umol/L-组氨醇和0.5ug/ml四环素的选择培养液（含或不含3ug/ml嘌呤霉素）
不含组氰酸的DMEM
100单位/ml靑霉素
100ug/ml链霉素
2mmol/L谷氨酰胺
10%小牛血清
500umol/LL-组氨醇（由125mmol/L贮液稀释，在-20°C贮存）
0.5ug/ml四环素-HC1(溶于70%乙醇，浓度10mg/ml,贮存于-20°C。）
IrvineScientific公司（SantaAna，Califomia）出售不含组氨酸的DMEM。含有0.5ug/ml四环素-HCl的选择培养液在4°C可以避光保存大约1个月。
适当的时候加3ug/ml嘌呤霉素。

特殊设备

塑料克隆环
克隆环竖放在一薄层其空脂上离压灭菌

聚丙乙烯管（4ml)

组织培养皿（6cm和10cm)

组织培养板（24孔）

附加试剂

本阶段步骤3需要列在本方案阶段1中的试剂。

载体和菌株

pPGKPuro(或带有其他选择标记的载体）
所有质粒都用CaCl-液化乙锭梯度平衡离心（第1章方案10）或层析柱纯化（第1章方案9)。
关于选择标记的信息，请见Damke等（1995)。质粒pTet-Splice和PUHC13-3在LifeTechnologies公司有售。其他带有选择标记的载体也有出售（如Piomega公司有pCI-neo,CLONTECH公司有pTK-HVG或pPUR)。如果以其他载体代替pPGKPuro,就用适合该质粒所带选择标记的选择培养液。

带有报道基因的pTet-Spliqe(可选，如PUHC13-3)
带有靶基因开放阅读框的pTet-Splice

细胞和组织

可诱导表达自调控tTA的稳定细胞系（阶段1)

方法

培养和转染细胞

1.在含有500umol/LL-组氨醇和0.5ug/ml四环素-HCl的完全选择培养液中培养可以诱导表达自身调控的tTA的稳定细胞系（阶段1中分离得到)。转染前一天，把细胞传代到含有完全选择培养液的10cm组织培养皿中。每个培养皿转入足量细胞，使转染那天单层细胞可以有33%的汇合度。
重要：从这时起除非特别说明，细胞都在37°C,5%CO₂，含有0.5ug/ml四环素-HCl的培养液中培养。

2.在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每种质粒的浓度调整为≥0.5mg/ml。每种粑基因质粒10~20ug和1~2ugpPGKPuro(每种四环素质粒与带选择标记的质粒的摩尔比为10:1)与500ulHEPES缓冲液在一个干净的4ml聚丙乙烯管中混合。


3.进行阶段1中的步骤3~13。
重要：阶段1中要求用含四环素的DMEM完全培养液的地方，在本转染中一定要换成含有500umol/LL-组氨醇和0.5ug/ml四环素-HCl的选择培养液。

选择和克隆转染细胞

4.转染后48h,细胞用几种稀释度分到含有500umol/LL-组氨醉、3ug/ml嘌呤霉素和0.5ug/ml四环素的选择培养液中。细胞密度为每个10cm培养皿大约1X10⁶到3X10⁴、含有大约1X10⁵细胞的培养皿需要培养若干个。
可以在几天内杀死所有未转染细胞的嘌呤霉素的最低浓度需要在转染前依靠经验确定，而且随着细胞类型不同而有不同。3ug/ml嘌呤霉素足以筛选转染的NIH-3T3细胞。嘌呤霉素在到的浓度范围内可以有效地杀死大多数类型细胞。

5.细胞在选择培养液中培养4天后，接着用3~4ml含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素和0.5ug/ml四环素的选择培养液培养。

6.集落长好以后（选择培养12~14天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿中挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。

7.用大约100ul磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加2滴1X胰酶-EDTA(~100ul)并放置30~60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到24孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有1ml含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素和0.5ug/ml四环素的选择培养液。
随后的细胞传代都用标准方法，如(1)PBS快速洗涤，(2)1~3min胰酶-EDTA消化（每个铺满细胞的培养皿加2ml),用10%小牛血清（3ml)稀释/终止胰酶的活性。

8.当孔中的细胞长到80%汇合度，把它们转移到6cm组织培养皿中，用含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素和0.5ug/ml四环素的选择培养液培养。
NIH-3T3细胞可以在大约4~7天生长到80%汇合度；但是不同细胞系甚至不同克隆生长到80%汇合度所需的时间是不同的。

9.细胞在含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素和0.5ug/ml四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行1:5到1:10稀释)。

10.当单层细胞再次生长到大约80%汇合度，每个细胞充隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试靶基因蛋白的诱导表达。测试方法在阶段3介绍。
以后使用冻存细胞的时候，需要复苏，然后在含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素和0.5ug/ml四环素-HCl的选择培养液中培养。


阶段3:分析转染钿胞中的蛋白质表达

材料

缓冲液和溶液
贮存液稀释到适当浓度。

小牛血清（10%)
磷酸缓冲液

1X蛋白样品缓冲液

抗体
适于用免疫印迹法测定感兴趣的靶蛋白的抗体

凝胶

Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶
灌胶所用的丙烯酰胺浓度要适于靶蛋白的观察，见附录8。

培养液

含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素的选择培养液（含或不含0.5ug/ml四环素）
不含组氨酸的DMEM
100单位/ml育霉素
100ug/ml链霉素
2mmol/L谷氨酰胺
10%小牛血淸
500umol/LL-组氨醇（由125mmol/L贮液稀释，在-20°C贮存）
3ug/ml嘌呤霉素
IrvineScientific公司（SantaAna,California)出售不含组氨酸的DMEM。
适当的时候加四环素，使浓度为0.5ug/ml(四环素-HCl溶于70%乙醇，浓度10mg/ml，贮存于-20°C)。含0.5ug/ml四环素-HCl的选择培养液在4°C可以避光保存太约1个月。

特殊设备

沸腾的水浴锅

聚偏二氟乙烯（poiyvinylidenedifluoride，PVDF）膜

附加试剂

本方案步骤13需要列在附录8中用于免疫印迹法的试剂和设备。

细胞和组织

可诱导表达自身调控的tTA并含有携带感兴趣靶基因的质粒的稳定细胞系

方法

细胞的生长和诱导

1.诱导前一天晚上，细胞以适当的密度在含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素和0.5ug/ml四环素-HCl的DMEM培养液中培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。

2.第二天，用PBS洗细胞3次，每次都要轻轻旋转培养板。

3.第三次洗涤后，立即加入含有500umol/LL-组氨醇、3ug/ml嘌呤霉素但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养6~48h。
在稳定转染的NIH-3T3细胞中，通常诱导6h后有tTA和靶基因的表达，诱导大约12h后表达达到峰值。


收获细胞

4.细胞生长适当的时间后，快速收获并放到冰浴的管中。
如果用胰酶收获细胞，先用冷的不含钙和镁盐的磷酸缓冲液洗细胞，然后用冷的含有10%小牛血淸的选择培养液（根据需要，含或不含四环素）终止胰酶的作用。管子立即移到冰桶中。

5.每个克隆和对照都转移0.5X10⁶细胞到离心管中，然后所有管子在4°C以3000r/min(低或中速）离心5min。

6.加1ml冰冷的磷酸盐缓冲液洗细胞。如步骤5洗细胞，轻轻吸掉上清，不要扰动细胞沉淀。

7.细胞沉淀放在冰浴上，在离心管架上方的孔中轻快地旋动管于使沉淀变松，然后把它冻存在-70°C。

准备裂解物

8.细胞沉淀用30ul蛋白样品缓冲液重悬，轻轻地吹打细胞，然后振荡管子。
这步也可能在冻细胞前进行。

9.细胞在蛋白样品缓冲液中煮10min。

10.以最大速度离心2min收集细胞碎片。

11.在Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道加10ul细胞裂解物。
如果细胞裂解物不立即加到凝胶上，可以在-20°C贮存，但是在上样前需要再次煮沸。

12.用合适的时间跑胶（请见附录8)。

13.蛋白从SDS-聚丙烯酰胺凝胶电转移到PVDF膜上，用合适的抗体检测（请见附录8)。