核糖体失活展示系统实验 实验方法
| 实验材料 | RTA基因 试剂、试剂盒 | 结合（或漂洗）缓冲液生物素琼脂糖洗脱缓冲液 仪器、耗材 | RNeasy™mini试剂盒 实验步骤 | 这里介绍的方法概括了表达载体的构建以及筛选功能蛋白的RIDS循环系统的构建。 3.1RIDS表达载体的构建 首先，需要准备含编码T7启动子、蛋白质文库、连接子、RTA和间隔区的DNA来构建RIDS(图13.2A)。13.3.1.1〜13.3.3.3部分详述了这个过程。尽管理论上用聚合酶链反应（PCR)制备双链DNA是可行的，但是我们推荐用质粒来构建此DNA，因为用PCR来连接不同部分（包括T7启动子、蛋白质文库、连接子、RTA和间隔区)，很难保证不会引入非特异性扩增。在这个章节中，我们描述了构建RIDS载体的过程。由于采用标准的重 组DNA方法来构建载体，因为篇幅有限，DNA的操作过程在此就不赘述了。 3.1.1构建pLRS表达载体 首先，我们需要准备通用载体pLRS，它像构建RIDS的DNA—样，能编码T7启动子、蛋白质文库、连接子、RTA和间隔区（图13.2A)。这个载体是基于pET30a载体（Novagen)的表达系统。我们通过将CDNA文库或者随机文库插入到pLRS载体的位点可以很容易地构建RIDS蛋白质文库。 用DNA合成仪合成连接子片段，并通过T7启动子下游的XbaI/XhoI位点插入到pET30a载体中。连接子编码了 NheI、噬菌体M13基因II的甘氨酸/丝氨酸富集序列、NcoI、BamHI、Pstl和XhoI(顺序从上游开始）。编码RTA的DNA是通过PCR从pUTA质粒中（获赠于得克萨斯大学的J.Robertus教授）得到的，并且将其通过NcoI/BamHI位点插入到甘氨酸/丝氨酸富集序列的下游。编码间隔区的DNA来源于噬菌体M13基因HI，并且通过BamHl/Pstl位点插入到RTA的下游。DNA的序列(不包括插入的RIDS蛋白质文库序列）如图13.2B所示。   T7启动子和蛋白质文库第一个ATG之间的71-mer序列来自于pET30a载体。RTA上游灵活的连接子对于初生蛋白折叠成正确的三维结构，去除蛋白质文库和下游RTA之间的空间阻隔是必需的。之前的研究表明，被选择的蛋白质/mRNA量强烈依赖于这个连接子的长度、组成和序列[6，16，17]。在目前的研究中，我们用44个含有甘氨酸/丝氨酸富集序列的氨基酸作为连接子。 去除RTA的空间阻隔是非常重要的。这是因为，在RIDS中通过引进RTA基因来达到稳定mRNA-核糖体-蛋白质复合体的目的。除了这个连接子之外，可读框(ORF)3"端的间隔区也是非常重要的。这个间隔区作为锚来连接核糖体，必须有合适的长度才能占据核糖体的长通道[18，19]，并且允许初生RTA正确折叠而没有任何空间障碍[20，21]。已经有报道，C端至少需要20〜30个氨基酸的间隔区来保持展示在核糖体上的酶的活性[22，23]。因此，核糖体展示系统上分离出的mRNA量会受到间隔子的长度，及其3"端二级结构的影响。我们在ORF的3"端分别引进一个长的和一个短的间隔区序列，比较它们在翻译和选择方面的影响。我们发现，在我们的系统里，长的间隔子（由噬菌体M13的全长基因III编码的404个氨基酸）对于翻译和选择是不合适的。 所以，在我们所有的实验中，我们用121个氨基酸的片段作为间隔子。 3.1.2pStAv-R和pGST-R载体的构建 为了校正提出的方法和RIDS的潜在应用性，我们在DNA文库中引进编码链霉亲和素或GST基因作为模式研究（图13.3A)。这些蛋白质经常被融合进新发现的蛋白质或者与之相互作用的分子上，成功地研究新发现的融合蛋白的功能性质[25〜28]。链霉亲和素和GST分别结合到生物素和谷胱甘肽上，这种结合具有高亲和性和特异性。因此，分离和确认蛋白质-核糖体-mRNA复合体可能是很容易的。 从pSTA(冈山大学的M.Sisido教授所赠）和pGEX-4T-3(AmershamBiosicences)质粒上分别切除编码链霉亲和素和GST的DNA。用PCR方法将这些片段进行扩增，并分别连接到pLRS质粒的XbaI/NhI位点中，构建成pStAv-R和pGST-R质粒。 编码链霉亲和素或者GST的DNA的序列如图13.3B，13.3C所示。    3.1.3pStAv-mR和pGST-mR质粒的构建 为了确认RTA有利于稳定核糖体复合体，在对照实验中，我们通过点特异突变的方法改变了RTA功能氨基酸，得到RTA的突变失活基因。步骤如下：第177位的谷氨酸突变成谷氨酰胺；第180位的精氨酸突变成组氨酸；第208位的谷氨酸突变成天冬氨酸。这3个氨基酸的突变完全抑制了RTA的活性[29，30]。为了构建pStAv-mR和pGST-mR质粒，每个质粒（pStAv-R或pGST-R)都采取标准的方法用RTA突变体基因替代RTA基因[31]，引物如下：5"-TTG CATCCAAATGATTTCAAAGCAGC ACA CTT CCA ATATAT TAG GGA GAA ATG-3"(下画线为E177A和R180H突变），以及5"-GAT CCT AGC GTA ATT ACA CTT GAG GAT CCT AGCGTA ATT ACA CTT GA-3"(下画线为E208D突变）。 3.2选择功能性蛋白的RIDS循环 采取标准的重组DNA方法，在含有随机文库或cDNA文库（在我们的模式研究中，是pStAv-R、pGST-R、pStAv-mR和pGST-mR)的ORF中，用XhoI酶切ORF的3"端产生线性DNA。这个酶切反应是终止转录必需的。 3.2.1DNA文库到mRNA的转录 在T7RNA聚合酶的作用下，DNA被转录，含有一个帽状结构类似物。在我们的模式研究中，在供应商（Epicentre TechnologiesCo.)的推荐下，用T7Ampliscribe™试剂盒转录DNA。 (1)根据供应商的推荐，向20μl转录混合物中添加1μg线性DNA。转录混合物含有3mmol/L帽状结构类似物、7.5mmol/LrATP、rCTP、rUTP；0.75mmol/LrGTP；10mmol/L反应缓冲液以及AmpliScribeT7酶溶液。 (2)在37°C静置反应混合液2〜4h，产生各种mRNA(我们将这些mRNA分别命名为：StAv-R、pGST-R、pStAv-mR和GST-mR)。 (3)在转录反应后，用DNaseI完全消化模板DNA，因为残余的模板DNA会影响后面的选择步骤。 (4)根据供应商（Qiagen)的推荐，用RNeasy™mini试剂盒纯化mRNA。 3.2.2核糖体-mRNA-蛋白质复合体的亲和选择和mRNA的分离 制备RNA编码文库（在我们的模式实验中，是StAv-R、pGST-R、pStAv-mR和GST-mR)和Flexi兔网织红细胞裂解系统（Promega;见注1)。 (1)向40μl翻译混合物中添加2μgmRNA。翻译混合物含有33μlFlexi兔网织红细胞裂解液、40mmol/L KCl、40μmol/L总氨基酸混合液、40URecombinant RNasin核糖核酸酶抑制剂（Promega)，用蒸馏水定容体积到50μl。不要添加DTT和Mg2+离子（见注1)。 (2)在30°C静置20min。在我们的研究中，3种mRNA体系被翻译（每种体系用2μgRNA，它们分别是：以1:1比例混合的mRNA，以及作为对照的编码链霉亲和素或者GST(StAv-R和GST-R)的mRNA；见注2）。 (3)翻译之后，添加1ml适当的结合缓冲液[见13.2(13)]和配基固定珠子。在我们的研究里，添加10μl生物素琼脂糖或者谷胱甘肽珠子的终止液（见注3)。 (4)在4°C静置1h，温和地搅拌有利于结合反应。尽管静置在室温下也是可以的，但是我们推荐4°C。因为在反义转录PCR(RT-PCR)里有时会检测到非特异性的结合(见注4)。 (5)在结合反应后，用500g的转速离心1min来沉淀配基固定珠子。 (6)去掉含有未结合mRNA和蛋白质的上清液。 (7)添加200μl漂洗液[见13.2(13)]，温和地混合30s。 (8)用500g的转速离心1min来沉淀配基固定珠子。 (9)去掉含有未结合mRNA和蛋白质的上清液。 (10)重复漂洗步骤（7〜9) 2次或者3次。 (11)添加100μl洗脱缓冲液[见13.2(16)]，室温用力地摇动30min，从沉淀配基固定珠子上分离出结合的mRNA。 (12)根据供应商的推荐，用RNeasy™试剂盒纯化洗脱下来的mRNA，用真空泵浓缩纯化后的mRNA。 3.2.3反义转录 用RT进行反义转录反应。在我们的模式研究中，根据供应商的推荐，用ReverTra Ace (Toyobo)进行反义转录反应。 (1)将纯化后的mRNA、4μl10μmol/LRT引物、每种10mmol/LdUTP2μl、4μl5XRT缓冲液，用蒸馏水定容到18μl，根据供应商的推荐，不加RNase抑制剂和ReverTraAce。RT引物用来（5"-GTGTAGCTTTGCACAGTGGC-3")识别RTA序列的上游部分。 (2)将混合物在65°C下放置5min变性后，迅速放到冰上冷却。 (3)向混合物中添加1μlRNase抑制剂和1μlReverTraAce。 (4)42°C静置1h进行反转录。然后99°C静置5min将酶失活。 3.2.4聚合酶链反应 用热稳定DNA聚合酶进行PCR反应。在我们的模式研究中，根据供应商的推荐，用KODDash(Toyobo)进行PCR反应。 (1)将20μlcDNA、10μl10XPCR缓冲液、每种2mmol/LdUTP10μl、1μl10mmol/LRT(作为下游引物），以及2μl10μmol/L上游引物，用蒸馏水定容到99μl，不添加KODDash。上游引物（5"-AATTTTGTTTAACTTGAAGGAG-3"）用来识别T7启动子序列的下游部分。 (2)将混合物在98°C下放置2min变性后，迅速放到冰上冷却。 (3)添加0.5μlKODDash。 (4)运行PCR程序（98°C1min；然后98°C10s，55°C2s，72°C30s，循环15〜30次；最后72°C10min)。98°C静置1min。 |
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发布于 ： 2018-08-08
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