粘粒及质粒文库的铺平板和转移实验 实验方法
| 实验材料 | 质粒 试剂、试剂盒 | LBNaOH氯霉素Tris·ClNaCl 仪器、耗材 | 硝酸纤维素滤膜离心机布氏漏斗培养箱 实验步骤 | 1. 在含抗生素的平板上，通过系列等比稀释确定质粒和粘粒文库的滴度，计算出最佳的铺平板用的细菌悬液量并稀释到5~10mlLB培奍基中。 2. 准备一层无菌的10cm或15cm的Whatman3MM滤纸，故在玻璃布氏漏斗或瓷质过滤漏斗中，加入10~20mlLB培养基。 3. 将标记好方向的硝酸纤维素滤膜放入含抗生素的LB平板中，并移至过滤装置，再将细菌悬液用吸管加到滤膜上，注意不要往滤膜边缘4~5mm处加液体。 4. 慢慢抽吸液体，待菌悬液被吸干之后，揭下滤膜并移至含抗生素的平板中，置于37℃培养，直至长出直径达1~2mm的菌落。 5. 标记并浸湿另一张硝酸纤维素滤膜。 6. 先将长有克隆的滤膜（细菌面朝上）放在几张20cm×20cmWhatman3MM 滤纸上。 7. 戴上手套把浸湿的硝酸纤维素滤膜按标记好的位置覆盖到长有细菌的膜上，膜于膜之间最好错开2~3mm，以便于滤膜之间的分离。 8. 在硝酸纤维素膜上覆盖3张20cm×20cm的3MM滤纸，并同样大小的玻璃平板压在其上，转印克隆。 9. 移去压在滤膜上的玻璃平板和滤纸，用20-G针头在重叠的原滤膜和转印膜上刺一小孔以标记方向。 10. 然后将它们分开，有菌落的一面朝上分别放入琼脂平板中过夜生长，转印膜于37℃培养，原滤膜则于25℃培养。 11. 主琼脂平板保存于4℃，或继续进行转印实验。 12. 将滤膜转栘到含50μg/ml氯霉素的LB平板上，37s℃培养4~10h，以扩增粘粒和质粒。 13. 接着，滤膜转印面朝上，依次放在3张分别饱蘸下面3种液体的46cm×75cm3MMWhatman滤纸上5min。 （1）0.5mol/lNaOH （2）1mol/lTris·Cl，pH7.5 （3）1mol/lTris·Cl，pH7.5/1.25mol/lNaCl 14. 用3MM滤纸将滤膜吸干后于80℃真空烤炉干烤90min。 15. 采用切口平移标记的探针与滤膜作杂交实验。 |
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发布于 ： 2018-08-05
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