【下列各项功能中,与固醇类物质无直接关系的是()A.参与血液中脂质...
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产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格(元) |
HifairTM ⅡReverseTranscriptase 第二代耐热逆转录酶 | 11110ES92 | 10000U | -20℃ | 626.00 |
HifairTM ⅡReverseTranscriptase 第二代耐热逆转录酶 | 11110ES93 | 5×10000U | -20℃ | 2456.00 |
产品描述
HifairTM ⅡReverseTranscriptase是在HieffTM M-MLV(H-)ReverseTranscriptase基础上通过基因工程技术得到的全新逆转录酶,与HieffTM M-MLV(H-)ReverseTranscriptase相比,其热稳定性大幅度提高,可耐受高达50℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。HifairTM ⅡReverseTranscriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可扩增长达10kb的cDNA。
产品组分
编号 | 组分 | 产品编号/规格 |
11110ES92(10000U) | 11110ES93(5×10000U) |
11110-A | 5×HifairTM ⅡBuffer | 250μL | 5×250μL |
11110-B | HifairTM ⅡReverseTranscriptase(200U/μL) | 50μL | 5×50μL |
产品应用
全长cDNA文库构建;终点法PCR;实时定量PCR等。
活性定义
以Poly(A) .Oligo(dT)为模板-引物,在37℃,10min内,将1nmol的dTTP掺入为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
质量控制
核酸外切酶残留检测:200U本酶和1μgλDNA-HindⅢ,37℃下孵育1h,DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测:200U本酶和1μg SupercoiledpBR322DNA,37℃下孵育1 h,DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测:200U本酶和1μg小鼠肝脏总RNA,37℃下孵育1h,RNA电泳谱带不发生变化。
运输与保存方法
冰袋运输。-20℃保存。
注意事项
1)请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用耗材均需保证RNasefree,以防止RNase污染;
2)所有操作均应在冰上进行,防止RNA降解;
3)为保证高效率逆转录,建议使用高质量的RNA样本;
4)为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
第一链cDNA合成操作步骤
1.RNA变性(此步为可选步骤,RNA变性有助于打开二级结构,可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。)
组分 | 使用量 |
RNasefreeddH2O | to13μL |
Oligo(dT)18 (50μM) orRandomPrimers(50ng/μL) orGeneSpecificPrimers(2μM) | 1μL |
or1μL |
or1μL |
模板RNA | TotalRNA:1ng-5μg或mRNA:1ng-500ng |
65℃加热5min,迅速置于冰上冷却2min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液,并用移液器轻轻吹打混匀。
2. 逆转录反应体系配制(20μL体系)
组分 | 使用量 |
上一步的反应液 | 13μL |
5×HifairTM ⅡBuffer | 4μL |
dNTPMix(10 mM) | 1μL |
HifairTM ⅡReverseTranscriptase(200U/μL) | 1μL |
RNaseinhibitor(40U/μL) | 1μL |
3. 逆转录程序设置
温度 | 时间 |
25℃ | 5min |
42℃ | 30-60min |
85℃ | 5min |
【注】:1)当使用RandomPrimers时,需25℃,孵育5min;若使用Oligo(dT)18或GeneSpecificPrimers,此步可省略;
2)逆转录温度:推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到50℃;
3)85℃加热5min,目的是使逆转录酶失活。
※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应,也可-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。
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HB170622
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