蛋白质去磷酸化方法

确定磷酸化特异性抗体的磷酸化特异性对于 PhosphoSolutions 来说是一项重要的业务。该分步方法分为两个主要部分，介绍如何以正确的方式使蛋白质去磷酸化。每个部分都有详细的步骤、缓冲区、特定材料和计算示例列表，以帮助研究人员完成这个综合过程。此外，整个协议中还提供了有用的技术提示，以深入了解执行蛋白质去磷酸化时应考虑的各种因素。我们的目标是提供必要的技术和工具，帮助研究人员获得可发表和可重复的结果。

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膜上固定的蛋白质去磷酸化

所需材料：

蛋白质膜印迹：-PVDF推荐使用膜。-参考Western Blot Protocol（直至Protein Transfer）制备蛋白膜印迹。Lambda 磷酸酶：SigmaAldrich 产品，包括 10X 磷酸酶缓冲液和 10X MnCl2，目录号：P96141X 孵育缓冲液：用 dH2O 稀释至 1X 的 Lambda 磷酸酶缓冲液和 MnCl2 溶液碱性磷酸酶：Sigma Aldrich 产品，目录号：P0114 带螺帽的锥形管或微量管去离子水 (dH2O) 洗涤缓冲液 (1X TTBS)：14 mM NaCl、2 mM TRIS、1%(w/v) Tween 20、pH 7.6100% 甲醇

该蛋白质去磷酸化方法采用两步法，重点关注特异性和效力。第一个处理是用 lambda 磷酸酶特异性靶向苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸氨基酸的磷酸基团进行去磷酸化。大多数磷酸酶仅使丝氨酸和苏氨酸氨基酸去磷酸化。如果您要测试酪氨酸磷酸化特异性抗体的磷酸化特异性，则 lambda 磷酸酶至关重要。第二次去磷酸化处理是用碱性磷酸酶完成的，这是一种比 lambda 磷酸酶更有效的酶。碱性ph磷酸酶仅使苏氨酸和丝氨酸氨基酸的磷酸基团去磷酸化，因此不打算单独用于确定酪氨酸磷酸特异性抗体的磷酸特异性。当同时使用 lambda 和碱性磷酸酶时，最好分开处理，这样碱性磷酸酶就不会抑制 lambda 磷酸酶的活性。有多种磷酸酶可用于使蛋白质去磷酸化；本协议中列出的是推荐示例。强烈鼓励最终用户在确定抗体的磷酸特异性之前优化其选择的磷酸酶。

在此协议中，我们指的是膜的磷酸酶处理部分（处理过的）和未处理过的部分膜（对照）。

膜制备A．新鲜制备的膜完成蛋白质转移至 PVDF 后，用 dH2O 冲洗膜。切割膜并将每个部分放入单独的容器中含有 dH2O 的容器。技术提示：最好使用由大槽凝胶制备的膜。将每个切片的膜切成两半。如果使用多个泳道，请通过用丽春红 S 染色膜来识别泳道。每次处理时切割新鲜的湿膜。将膜部分放回盛有水的容器中。使用洗涤缓冲液洗涤 3 x 5 分钟，完全去除丽春红 S 污渍。可能需要额外的清洗。为了区分两个部分和方向，在每个膜的右上角做一个小切口，并在容器上贴上\"对照”和\"已处理”标签。在标记膜部分时，需要使用中性笔，以免墨水被洗掉离开。然而，膜只有在干燥后才能进行标记。将膜在洗涤缓冲液中室温摇动 5 分钟。处理前请勿干燥膜。技术提示：为每个膜切片选择一个容器，以最大限度地减少将印迹完全浸入洗涤缓冲液所需的体积。继续进行\"蛋白质去磷”修饰’.B.灭活膜切割干燥的灭活膜并贴上标签。技术提示：在进行单次磷酸特异性测试时，可以切割并使用条带，而不是处理一大片膜。这对于保存特殊的、难以制备的裂解液来说是最佳选择。在标记膜切片或膜条时，需要使用中性笔，这样墨水就不会被洗掉。膜条和切片可以标记为\"C”表示对照，\"T”表示处理过的在激活膜之前。通过将 PVDF 膜的两半浸入选定容器中的甲醇中 30 秒来激活它们，然后用 dH2O 彻底冲洗膜的两半。技术提示：为每个膜部分选择一个容器，以最大限度地减少所需的体积将印迹完全浸入洗涤缓冲液中。在洗涤缓冲液中洗涤膜 3 x 5 分钟。技术提示：如果膜被 Ponceau S 染色，则可能需要额外洗涤。在继续之前，必须将污渍从膜上完全洗掉。计算总体积1X 孵育缓冲液需要完全浸没每个容器中的所有对照和处理过的膜切片或条带。继续进行\"蛋白质去磷酸化”。蛋白质去磷酸化准备完全浸没所有膜切片或条带所需的计算出的 1X 孵育缓冲液总体积。将 1X 孵育缓冲液分成 2 部分：一份标记为\"已处理”，一份标记为\"对照”。将每 mL 孵育缓冲液 5 μL 的 lambda 磷酸酶添加到标记为\"已处理”的容器中。从膜上除去洗涤缓冲液，并将准备好的对照和已处理溶液添加到相应的膜部分中或条状。在室温下摇动孵育 4 小时，或在室温下摇动过夜。技术提示：建议使用密封容器以防止蒸发。将每 mL 孵育缓冲液添加 1 μL 碱性磷酸酶到标记为\"已处理”的容器中。在室温下摇动，再孵育 30 分钟。丢弃 1X 孵育溶液。用清水彻底冲洗膜th dH2O.Tech 提示：如果需要，用丽春红 S 保留膜的两半以可视化蛋白质并去除多余的膜或切割泳道。通过用 dH2O 冲洗并风干来停用膜。一旦膜完全失活并且蛋白质固定到膜上，膜就可以进行封闭和抗体孵育（蛋白质印迹实验方案的一部分）。技术提示：为了加快干燥过程，请在用 100% 甲醇冲洗膜后，用 100% 甲醇冲洗膜。 dH2O. 裂解液中蛋白质的去磷酸化

所需材料：

10X 裂解缓冲液：100 mM TRIS、100 mM NaCl，pH 8.0 裂解缓冲液洗涤剂：10% (v/v) NP40-LB10% SDS：磷酸酶灭活剂Lambda 磷酸酶：Sigma Aldrich 产品，包含 10X 磷酸酶缓冲液和 10X MnCl2，目录号：P9614 碱性磷酸酶：Sigma Aldrich 产品，目录号：P01141X 裂解/孵育缓冲液：由 10X 裂解缓冲液、10X 磷酸酶缓冲液和 10X 制备MnCl2 溶液抹刀、塑料移液管等剪刀锥形管或带螺帽的微量管冰去离子水 (dH2O) 热块：设置为 95°C 声波发生器：根据裂解缓冲液体积和试管尺寸选择探针并优化强度，以避免蛋白质样品起泡。

此蛋白质去磷酸化方法使用两种方法- 注重特异性和效力的分步方法。第一个处理是用 lambda 磷酸酶特异性靶向苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸氨基酸的磷酸基团进行去磷酸化。大多数磷酸酶仅使丝氨酸和苏氨酸氨基酸去磷酸化。如果您要测试酪氨酸磷酸化特异性抗体的磷酸化特异性，则 lambda 磷酸酶至关重要。第二次去磷酸化处理是用碱性磷酸酶完成的，这是一种比 lambda 磷酸酶更有效的酶。碱性磷酸酶仅使苏氨酸和丝氨酸氨基酸的磷酸基团去磷酸化，因此不打算单独用于确定磷酸特异性酪氨酸磷酸特异性抗体的有效性。当同时使用 lambda 和碱性磷酸酶时，最好分开处理，这样碱性磷酸酶就不会抑制 lambda 磷酸酶的活性。有多种磷酸酶可用于使蛋白质去磷酸化；本协议中列出的是推荐示例。强烈鼓励最终用户在确定抗体的磷酸特异性之前优化其选择的磷酸酶。推荐示例的计算可在协议末尾找到。了解所选择的磷酸酶的比活性以确定所需酶的量非常重要。如果去磷酸化纯蛋白质和分子量已知，则使用该数字来确定所需的每种磷酸酶的量。如果您正在准备混合蛋白质的裂解物，最好使用平均分子量的假设，也称为经过深思熟虑的猜测。计算出的磷酸酶体积是确定蛋白质去磷酸化所需量的起点。由于计算基于假设，因此可能需要额外的实验优化。

裂解液制备测定器官或组织培养细胞的蛋白质质量。技术提示：器官：刷掉冷冻器官中的任何碎片。用 1X PBS 清洗新鲜器官并用 Kimwipe 干燥。称量新鲜或解冻的器官。将蛋白质质量估计为总质量的 10%。悬浮细胞：根据细胞计数进行估计。贴壁细胞：由于非最佳裂解条件，不建议将此方案用于贴壁细胞。建议使用\"膜上固定蛋白去磷酸化”方案。根据样品的估计蛋白质质量，计算所需的裂解液终浓度。技术提示：建议使用低于 10 mg/mL 的终浓度以获得最佳裂解效果。使用以下公式计算浓度：确定所需蛋白质浓度所需的体积并准备 1X 裂解/孵育缓冲液。裂解前在冰上冷却 30 分钟。技术提示：将所有裂解/孵育缓冲液成分调至最终浓度浓度为 1% 或 1X。10% NP40-LB 或 10% Triton 是推荐用于制备 1X 裂解缓冲液的去垢剂。这些去垢剂可以保留蛋白质并裂解大多数酶，但不会裂解磷酸酶。1% SDS 可以裂解所有物质，包括磷酸酶。去磷酸化处理前不要使用 10% SDS，这一点很重要。在适当体积的锥形管或微量管中，将计算量的新鲜制备的冷冻裂解缓冲液添加到器官/细胞中，以达到所需的浓度。保留样品在冰上冷冻。记下添加的裂解缓冲液的体积。技术提示：器官：对于大型器官，切成 1/4 英寸的部分。对于又厚又密的器官，可以切成更小的切片。悬浮细胞：将培养基和细胞移入锥形管中。通过离心（1 分钟，1800 x g）沉淀细胞并除去培养基。用 1-3 mL 室温 1X PBS 重悬细胞进行洗涤。重复离心沉淀并除去 1X PBS。添加所需体积的裂解缓冲液。以 5-20 秒的间隔对样品进行超声处理，直至溶液澄清并且可以轻松移液而不会堵塞。超声处理时和超声处理完成后，将样品保持在冰上。技术提示：器官和细胞膜在裂解液中将显示为白色、丝状碎片。研究跨膜蛋白时，必须完全裂解这些碎片。为避免刺穿/熔化塑料管，请尽量减少探针与锥形管壁的长时间接触。为避免起泡，请将探针尖端浸入裂解液中，直至超声处理完成。移液器超声处理后的样品。如果裂解液在 p 时发生堵塞再次吹打，超声处理，直至不再出现堵塞。将裂解液分成 2 个等体积：标记一个对照裂解液，该裂解液不会用磷酸酶处理。标记另一种经过处理的裂解物，该裂解物将用磷酸酶进行处理。记下每个样品的体积。向对照裂解液中加入 10% SDS，直至最终浓度为 1% SDS。记下添加到对照裂解液中的 10% SDS 的体积。将控制裂解液在 95°C 加热 10 分钟。将样品放在一边，置于室温下。蛋白质去磷酸化每 1 mg 蛋白质向处理过的裂解液中添加 1 μl lambda 磷酸酶。记下添加到处理过的裂解液中的酶的体积。在室温水浴中孵育 30 分钟。技术提示：建议在使用裂解物确定未知磷酸抗体的磷酸特异性之前先测试去磷酸化裂解物。尝试使用已知的磷酸化特异性抗体，该抗体在相同类型的残基（即 Ser）上被磷酸化，Thr，或 Tyr 作为你的未知数。由于最初的计算是基于假设，因此可能需要进一步优化酶量和孵育时间。在处理过的裂解液中每 10 mg 蛋白质添加 1 μl 碱性磷酸酶。记下添加到处理过的裂解液中的酶的体积。在室温水浴中孵育 10 分钟。向处理后的裂解液中添加 10% SDS，直至最终浓度为 1% SDS，并置于 95°C 加热块中 10 分钟以灭活磷酸酶。记下添加到处理过的裂解液中的 10% SDS 的体积。将之前步骤中添加到每个裂解液中的记录试剂体积加在一起。使用新鲜制备的含 1% SDS 的裂解缓冲液将裂解液调整至等体积。使用对照裂解液测定蛋白质浓度。技术提示：本方案中使用的酶制备的 10X 缓冲液含有 DTT，该试剂会干扰BCA 测定。建议使用不同的屁股可以确定蛋白质浓度。不建议使用处理过的裂解液来确定蛋白质浓度，因为由于磷酸酶的存在，浓度将高于对照。裂解液已准备好用于测定应用或可以冷冻在 - 80°C 适合长期保存。技术提示：当生产大量经处理的细胞或器官时，为了方便起见，建议将裂解物等分成小体积以供单独的测定应用。磷酸酶计算

重要因素、物理常数和假设：

阿伏加德罗数：6.023 x 1023 分子/mol 蛋白质裂解物的假定平均分子量：100,000 道尔顿 (g/mol)磷酸酶的比活性Lambda 磷酸酶：1 单位每分钟水解 1 nmol 磷酸盐； 1 μl lambda 磷酸酶含有 400 个单位，因此每 1 μl 磷酸酶每分钟将水解 400 nmol 磷酸盐。碱性磷酸酶：1 单位水解 1 mmol 磷酸盐每分钟; 1 µl 碱性磷酸酶含有 133 个单位，因此每 1 µl 磷酸酶每分钟将水解 133 mmol 磷酸盐。如果您知道该纯蛋白质的确切大小和数量，请使用这些数字。如果没有，请不要惊慌！在这些场景中最好使用假设（又名受过良好教育的猜测）。计算出的磷酸酶体积是确定 10 毫克蛋白质去磷酸化所需量的起点。由于计算基于假设，因此可能需要额外的实验优化。

裂解物计算示例

第一个计算是将蛋白质裂解物样品从毫克转换为分子。该量对于确定所需的每种磷酸酶的量很重要。由于裂解物是蛋白质的混合物，因此将使用假设的平均分子量 100,000 道尔顿 (g/mol) 来简化计算。在此示例中，有 10 毫克蛋白质（2 毫升裂解液，浓度为 5 毫克/毫升）将用磷酸酶。

平均蛋白质分子量：100,000 g/mol

有~6.023 x 10^{10 毫克蛋白质需要 16 个分子。}

λ 磷酸酶计算

第二个计算将把 λ 磷酸酶单位数转换为分子/分钟。需要注意的是，反应时间和酶量一旦确定即可调整。

每 1 μl λ 磷酸酶添加到反应中，它将水解 2.41 x 1017 磷酸盐分子。最终计算现在可以确定反应需要多长时间。

 

使用 1 μl lambda 磷酸酶需要 15 秒才能完全去磷酸化 10 mg 蛋白质。

碱性磷酸酶计算

将执行相同的步骤来计算反应所需的碱性磷酸酶的量。请注意，碱性磷酸酶的比活性与 Lambda 磷酸酶不同。

使用1μl碱性磷酸酶完全去磷酸化10mg蛋白质需要0.045秒。

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Western Blot 协议

我们的 WB 实验方案分为 5 个部分：样品制备、SDS PAGE、蛋白质转移、免疫标记和成像，解释并强调了 vario我们在实验中应考虑的因素。

裂解液制备方案

学习在专注于保留蛋白质磷酸化时如何正确裂解器官和组织培养细胞，包括裂解贴壁和悬浮组织培养细胞的详细差异。

是什么让我们与众不同？如果我们尝试制造抗体但不起作用，我们就会扔掉它。我们从不出售无法在我们手中发挥作用的抗体。我们致力于严格的验证标准，确保内源蛋白的清晰信号，并验证相关产品的磷酸特异性。我们致力于重现性。寻找我们的\"混合血清”图标。每个带有此图标的抗体都是从其自己的血清池中纯化出来的确保批次间的一致性。我们保证我们的抗体。如果您无法让抗体在您的应用中发挥作用，我们将提供 100% 退款。在制作定制抗体时，我们从始至终提供个性化的客户支持，从肽设计、纯化到表征。