abbexa 电泳迁移率变动分析 |阿贝克萨有限公司
电泳迁移率变动分析 (EMSA) 或凝胶迁移率变动分析是一种流行且强大的检测 RNA-蛋白质相互作用的技术.它依赖于在非变性凝胶上具有一定流动性的裸露 RNA。如果 RNA 被蛋白质结合，则 RNA 的迁移率会降低。因此，蛋白质的结合导致凝胶上 RNA 的特征性向上移动，如使用放射性标记的 RNA 监测的那样。 EMSA 可以使用复杂的蛋白质混合物（例如细胞提取物）进行，它们可用于研究广泛的 RNA-蛋白质相互作用；单个蛋白质结合事件（简单的相互作用），由 RNA 形成的小复合物，以及大型多组分 RNA-蛋白质复合物的组装（例如，剪接体）。
A.试剂和设备试剂丙烯酰胺（40% 库存）用于迁移率变动分析的结合缓冲液双丙烯酰胺（2% stock)Bovine serum albumin (BSA)Bromophenol blueGlycerolHeparin (50 mg/mL [w/v] in H2O)Loading buffer for mobility shift assaysNaCl感兴趣的蛋白质（纯化的蛋白质或细胞提取物）感兴趣的 RNA（统一标记和纯化）用于迁移率变动分析的剪接混合物 (4×)总 RNA 或 tRNA（10 mg/mL 来自酵母或大肠杆菌）Tris (pH 7.6)Tris/硼酸盐/EDTA (TBE)电泳缓冲液(10×)Tris-甘氨酸缓冲液(10×)二甲苯蓝设备电泳设备：包括立式凝胶仪；板（17 × 14.7 × 0.15 厘米）、梳子（带有 0.75 厘米宽的孔）和用于灌注凝胶的垫片（0.8 或 1.5 毫米厚）；和高压电源。适合结合温度的冰培养箱 (4˚C–37˚C) 微量离心管 (1.5 mL) 荧光成像仪设备或 X 射线胶片和增感屏 真空凝胶干燥器 Whatman 3MM 纸 B. ProcedureforSimple Interactions标记感兴趣的 RNA。标记 RNA与 [α-32P] NTPs 一致，使用体外转录。对于寡核糖核苷酸或 100–200 个核苷酸的纯化 RNA，使用 [32P] 胞苷 3\'、5\'-二磷酸或 [γ-32P] ATP 进行末端标记。在合适的结合条件下（例如结合添加 10 µg/mL BSA 的缓冲液）。 20 µL 结合缓冲液（辅以 10 µg/mL BSA）、1 µL RNA（50,000 cpm）和 4 µL 纯化蛋白（从过量到小于等摩尔的系列稀释）在冰上的混合物是合适的。将混合物孵育 30在室温、30 ˚C 或 37 ˚C 下 –60 分钟。用 4 µL 上样缓冲液（不含肝素）稀释样品，并将 10–20 µL 混合物上样到天然聚丙烯酰胺凝胶上。对于单一蛋白质 (50,000 MW) 和单一 RNA（长 100 个核苷酸），从 0.8 mm 厚的 6% 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 (30:1) 凝胶开始，该凝胶由 Tris–甘氨酸缓冲液或 TBE 制成。预运行凝胶 30 分钟。在 300V 下进行电泳 3 小时（或 13 V/cm），确保它不会 n不加热。如果怀疑相互作用不稳定，请在冷室中运行凝胶。使用一张 Whatman 3MM 纸捡起凝胶，并在 80˚C 下干燥。将凝胶暴露在磷光成像仪或 X 射线胶片上。
为了形成小复合体的更长 RNA 通过体外转录制备标记的 RNA 靶标。凝胶纯化 RNA 以确保底物将是凝胶上的单个条带。在合适的结合条件下将标记的 RNA 与纯化的蛋白质一起孵育。 20 µL 结合缓冲液（辅以 10 µg/mL BSA）、1 µL RNA（50,000 cpm）和 1-4 µL 纯化蛋白/细胞提取物在冰上的混合物是合适的。在首选温度下孵育 30–60 分钟(4˚C–37˚C)。孵育后，用含有 500 mM NaCl、10 mM Tris (pH 7.6)、5% 甘油和 200 µg/mL 肝素的缓冲液将反应稀释至 100 µL（如果细胞提取物使用）。在室温下孵育 10 分钟。从反应中取出 1 µL，并将其添加到 30 µL 的上样缓冲液中。确保第甘油浓度至少为 5%，这样样品就不会漂浮。将此样品加载到 1.5 mm 厚、20 cm 长的 0.5× TBE、6% 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 (60:1) 凝胶上。在 25 mA 下进行电泳，直到二甲苯氰醇在凝胶下约三分之二。拆卸凝胶，用 Whatman 3MM 纸将其捡起，并在 80˚C 下干燥。将凝胶暴露在磷光成像仪或 X 射线胶片上。对于大型多组分 RNA 蛋白复合物，制备含有 3.75%–4.2% 聚丙烯酰胺和丙烯酰胺：双丙烯酰胺 (80:1) 的天然凝胶。将溶液倒入 17 × 14.7 × 0.15 cm 板中，插入带有 0.75 cm 宽孔的梳子，并让凝胶聚合。 （这通常至少需要 30 分钟。）通过上下吹打在 1.5 mL 微量离心管中混合以下成分：5 µL 核提取物（15–20 mg/mL）或提取物透析缓冲液，1 µL RNA（25,000–50,000 cpm)、5 µL 剪接混合物 (4×)、9 µL H2O 在 20˚C–30˚C 下孵育 30–60 分钟。将试管置于冰上以停止反应。添加肝素（滴定范围在 5 到 500 µg/mL 之间）以减少非特异性结合。在反应中加入 3 µL 的 1% 二甲苯氰和溴酚蓝。通过上下吹打混合。或者，可以将染料添加到凝胶上的自由泳道以监测电泳并防止可能干扰蛋白质结合。在不超过 6 W 的条件下预运行凝胶 20 分钟。从步骤中加载 5 µL 结合反应混合物5 到凝胶上。在室温下以最大 120-210 V 以不超过 6 W 的功率运行凝胶，直到染料距离底部 1-2 cm（对于 70 核苷酸的 RNA）。将凝胶转移到 Whatman 3MM 过滤器上将纸在 80˚C 的真空凝胶干燥器上干燥 30–60 分钟。在 –80˚C 下使用增感屏将凝胶暴露在 X 射线胶片上。
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