控制流式细胞术的关键控制

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控制对于任何流式实验都至关重要，可以可靠地区分您的结果与背景变化和非特异性效应. 在这里，您将了解实验中应包括的基本对照，以及何时使用它们来获取发表质量数据。

在开始实验之前，请熟悉您将使用的仪器，以便您了解可用的激光器和滤光片。这将帮助您选择易于检测的兼容荧光团并选择最佳滤光片组。使用未染色的细胞来设置仪器，以便您的所有细胞都可以在前向散射 (FSC) 上轻松可视化) 和侧向散点图 (SSC)。然后设置 photomulti钳管 (PMT) 电压，以便可以将负细胞和暗信号与电子噪声区分开来，同时将亮细胞保持在刻度内。这将使您能够确定样品中背景荧光或自发荧光的水平（图 1），并为每个荧光通道适当设置电压，确保可以检测到所有信号。您将能够保存这些设置以备上传，为将来的实验做准备。可能仍需要进行微小的更改，但您可以最大限度地减少宝贵的样品量和设置实验所需的时间。

设置 PMT 电压的另一种方法是使用用八种不同荧光强度染色的珠子。对于此方法，选择能够提供第一和第二荧光峰之间最大差异的电压，以确保最佳的 PMT 灵敏度。然后根据需要进行微调，以避免非常亮的细胞超出刻度。然而，未染色的细胞应该仍然需要获取以确定自体荧光水平，这在异质群体中可能不同，例如不同细胞类型的外周血（图 1）。

< img alt=\"图 1. 未染色外周血\" longdesc=\"图 1. 未染色外周血\" src=\' https://static.bio-rad-antibodies.com/2020/flow/fig-1-unstained- peripheral-blood.jpg\' style=\"宽度：580px；高度：251px；\" title=\"图 1. 未染色外周血\">

图 1。 1. 未染色的外周血。未染色的外周血作为阴性对照设置 FSC、SSC 和 PMT 电压（561 nm 激光，显示 577/15 滤光片）。在直方图中可以清楚地观察到不同种群的自发荧光。红色，淋巴细胞；蓝色，单核细胞；绿色，粒细胞。

Fc 受体存在于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和 B 细胞上。它们通过恒定 Fc 结构域而不是抗原特异性 Fab 结构域结合抗体，leading 结合到非预期目标的多种抗体。

这种类型的结合会导致假阳性、阳性细胞和阴性细胞之间的分辨率降低以及数据不佳（图 2）。为了防止它，可以将 Fc 封闭试剂（例如人 Fc Seroblock 和小鼠 Seroblock FcR）添加到您的染色方案中，以确保仅观察到抗原特异性结合。或者，样本类型的稀释血清将与 Fc 受体结合（例如小鼠血清可用于小鼠细胞）。

图2. 在存在或不存在 Fc 块的情况下用 CD11a 对 THP-1 细胞进行染色。用 FITC 标记的小鼠抗人 CD11a、MCA1848F（蓝色直方图）或 FITC 标记的小鼠 IgG2a 阴性对照、MCA929F 对 THP-1 细胞进行染色（红色直方图），在不存在和存在 Human SeroBlock (BUF070A) 的情况下。

开发同种型对照用于表面染色。它们的作用是确保抗体结合的特异性，并且观察到的染色是由于特异性结合而不是人为因素。它们是针对一种抗原产生的，例如匙孔血蓝蛋白或二硝基苯酚，这些抗原在被分析的细胞类型或样本中没有发现。它们的选择应与宿主物种、Ig 亚类和一抗的荧光团相匹配，并以与一抗相同的浓度使用。此外，由于荧光团与抗体的偶联因供应商而异，我们建议从 s 购买同型对照和一抗相同的供应商。

需要注意的是，同种型对照可能不适合细胞内染色，不应用于设置门控。尽管使用它们的有效性可能会导致研究人员产生分歧，但它们可以揭示 Fc 阻断不足等问题。要详细了解如何在流式细胞术实验中使用同种型对照、何时使用它们以及使用哪些，请访问我们专门的同种型对照网页。

样品的质量将确定数据的质量。死细胞具有高水平的自发荧光和非特异性抗体结合，这可能导致假阳性和可检测动态范围的降低。这将使检测弱阳性样本和稀有人群变得困难。使用前向和侧向散射门可以排除碎片和一些死细胞，但不会将它们全部清除。因此，您的流式细胞仪面板中应包含活性染料。图 3 插图以小鼠骨髓为例，将活性染料与前向和侧向散射门相结合可显着提高数据质量。通过使用前向和侧向散射门排除死细胞，您可以识别小鼠骨髓中的 GR-1 和 CD11b 双阳性骨髓细胞（右上象限）（图 3a）。当引入活性染料时，在本例中为碘化丙啶，您可以看到相同的前向和侧向散射同时包含活细胞和死细胞（图 3b）。当活性染料与前向和侧向散射门组合时，CD11b 和 GR1 的染色更清晰，一些染色（可能来自紫色框突出显示的死细胞）已经消失（图 3c）。此外，现在可以看到 GR-1 和 CD11b 中的不同群体。

活性染料有两种类型。 DNA 结合染料，如碘化丙锭、7-AAD 和 DAPI，会在与核酸结合时发出荧光，但不能穿过完整的细胞膜。所以只有带有可渗透膜的死细胞才会发出荧光。这些染料的不同激发和发射波长允许包含在许多多色面板中，但样品无法固定。

第二种活性染料，蛋白质结合染料，与蛋白质上的游离伯胺共价结合，从而存在于细胞表面。当细胞膜受损时，染料会渗透细胞并与细胞内的伯胺发生反应。由于可接近的游离胺含量增加，在死细胞中观察到更强的荧光，使它们很容易与活细胞区分开来。 VivaFix Cell Viability Assays 是可固定的活性染料，与核酸结合染料相比，其激发和发射光谱范围更广，便于分析和添加到多色流式细胞仪面板。

图 3. Using a viability dye to exclude dead cells. A, 使用正向和侧向散射门来选择 Gr-1 和 CD11b 阳性小鼠骨髓中的细胞（右上象限）。B，活性染料碘化丙锭 (1351101) 显示前向和侧向散射门并不是从分析中消除死细胞的最有效门。C，使用活性染料丙锭的组合碘化物和正向和侧向散射门、CD11b (MCA711PB) 和 GR-1 (MCA2387F) 阳性细胞可在小鼠骨髓中鉴定。

活性染料也用于确定死细胞的比例细胞凋亡测定（例如膜联蛋白 V 或 FLICA 试剂盒）中的凋亡细胞。

补偿对照是单染的为您的 panel 中的每种抗体提供样品，并且对于任何多色实验都是必不可少的。它们揭示了荧光团溢出到其他检测器中的程度。然后可以通过数学方法消除溢出，确保在最终分析中仅使用特定信号。这称为补偿。这可以在图 4 中看到，其中来自 CD45RA 染色的 FITC 在补偿后从 PE 通道中移除。

图。 4. 补偿控制校正荧光溢出。人淋巴细胞用 CD45RA (MCA88) 染色。 A、无补偿染色在。 B，应用补偿后的染色。

每个荧光团的这种溢出应该在使用荧光团的每个通道中得到补偿。为了有效，补偿控制理想情况下应与样本一样明亮。样本中需要有阳性和阴性群体。如果 100% 的细胞具有阳性染色，例如外周血上的 CD45，则可以将未染色的细胞掺入样品中以产生阴性细胞群。您必须对样本和对照使用相同的荧光团，并且必须收集足够的事件。一个好的指南是正负总体均为 5,000，以便软件对溢出做出具有统计显着性的确定。

设置补偿后，请勿更改 PMT 电压，因为这会否定补偿设置。从历史上看，补偿是通过增加或减少补偿手动执行的，直到 ne 的平均荧光强度 (MFI)相邻检测器中的阳性和阳性种群相等。幸运的是，现代软件已经使这个过程自动化，从而提高了准确性。您可以获得有关荧光团的更多详细信息，以及可帮助您为实验选择最合适的荧光团的光谱查看器。

在采集和分析数据时，除了溢出之外，可能会发生荧光扩散，这在补偿后和来自更亮的荧光团时尤为明显。仔细选择正确的荧光团，并避免有大量扩散的通道，将有助于减少它。此外，FMO 控制将有助于确定阳性和阴性人群，从而确定设置门的位置（图 5）。每个 FMO 对照，顾名思义，就是将 panel 中所有荧光标记的抗体相加减去一个，以查看每个荧光团对 panel 的影响及其扩散到相邻通道的情况s（图 5）。理想情况下，应对面板中的所有荧光团执行 FMO 控制，尤其是在开始新的多色面板时。

下表 1 显示了 FMO 矩阵的示例。图 5 显示了荧光如何传播来自其他通道的数据会影响数据，因此考虑到荧光扩散，确保相应地定位门很重要。

管

FITC

PE

PE-A750

PE-Cy5

未染色

-

-

-

-

FITC – FMO

-

+

+

+

PE-FMO

+

-

+

+

PE-A750-FMO

+

+

-

+

PE-Cy5 -FMO

+

+

+

-

图。 5. 使用 FMO 控件来确定荧光扩散并设置准确的门控。点图显示荧光扩散到 FMO-PE-Cy5 对照中的 PE-Cy5 通道与未染色对照相比，允许对完全染色的样品进行正确的门控（黑色虚线）。

细胞内染色可能比表面染色更成问题，通常是由于蛋白质-蛋白质相互作用导致细胞内背景水平较高。同种型对照已针对细胞表面染色进行了优化，以控制抗体和荧光团的非特异性结合，因此它们可能并不总是适合用作细胞内染色对照。其他对照，例如阴性细胞系、已知对您的细胞呈阴性的抗体或单独的二抗（如果使用一抗和二抗ry 抗体）可用于确定特异性结合。单独使用二抗的例子见图 6。

图。 6. 单独二抗控制猪淋巴细胞染色。猪细胞用山羊抗小鼠 IgG1:RPE (STAR132PE) 作为单独二抗对照或 FITC 偶联小鼠抗猪 CD5 (MCA2307F) 和小鼠抗猪 SWC5 ( MCA6050GA) 用山羊抗小鼠 IgG1:RPE (STAR132PE) 检测。所有实验均在红细胞裂解的猪血上进行，这些血液在存在时对淋巴细胞进行门控10% 猪血清 ce。在 ZE5 细胞分析仪上采集的数据。

细胞内染色的良好对照示例是对外周血中的 T 细胞特异性标记物进行染色，并检查同一样本中的 B 细胞和单核细胞是否为阴性。此外，由于细胞内染色需要固定和透化，因此在不透化细胞的情况下进行染色将为您提供一些关于背景表面染色水平的信息。除了控制抗体外，还必须包括其他试剂的适当控制。用于细胞内染色的固定液和透化缓冲液可能会影响细胞的形态，因此您可能需要改变通常用于分析的门的位置。固定和透化条件可能需要优化，某些试剂可能不合适。要了解有关优化细胞内染色的更多信息，请访问我们的细胞内染色提示页面。

除了染色和同种型对照，您还应该考虑生物对照，这将使您能够确定染色的特异性和实验限制。生物对照对所有染色都很重要，尤其是细胞内染色，其背景荧光高于细胞表面染色.对照包括已知的阴性和阳性样本。这些示例包括：文献中已知表达或不表达目的抗原的细胞，使用 RNAi 或 CRISPR 技术敲除或去除抗原的细胞，或已转染且抗原正在结束的细胞表达以确保阳性染色。图 7 显示了一个示例，其中人外周血已针对 CD66b 进行了染色；淋巴细胞门内的细胞呈阴性，而粒细胞如预期的那样呈阳性。

图 7. 生物对照的使用。人外周血针对粒细胞特异性标记物 CD66b (MCA216F) 进行染色，并针对 CD16 (MCA1193) 进行复染。淋巴细胞被CD66b 阴性，而粒细胞阳性，显示特异性抗体染色。

对于其他实验，例如细胞因子释放测量或细胞活化，未刺激和完全刺激的对照很重要。这将确定阳性和阴性结果，实验中荧光染色的动态范围，并确保抗体按预期执行。图 8 中就是一个例子，其中人外周血淋巴细胞在受刺激和未受刺激的细胞上进行了 CD154 染色。这种类型的控件还可以帮助您选择最合适的荧光团，因为微小的变化可能会用更亮的荧光团获得更好的分辨率。选择正确的生物对照时，了解您的实验和样本很重要。

图。 8. 使用受刺激和未受刺激的对照。人外周血未经刺激或用 PMA 和离子霉素刺激 5 小时，然后进行 CD3 (MCA463A700) 和 CD154 (MCA1938PE) 染色。

对照只是流式细胞术中几个重要的实验考虑因素之一。其他示例包括仔细的样品制备、双重歧视、优化染色方案和适当的e 荧光团处理。有关这些主题的更多信息，请参阅我们的优化您的流程网络研讨会和我们广受欢迎的流式细胞仪指南。在构建多色 panel 时，您还应该在设计实验时注意荧光团的选择、抗原密度和抗体滴定。更多帮助和信息可以在本文末尾的资源中找到。