通过我们的细胞活力和细胞凋亡方案提高您的实验可靠性。

材料和设备：

细胞解离剂（例如胰蛋白酶）- 用于粘附仅细胞系

含FBS或胰蛋白酶抑制剂的细胞培养基

添加氯化钙的PBS或HBSS

台式离心机

荧光膜联蛋白V 探针

活性染料（例如，碘化丙啶）

流式细胞仪

使用流式细胞仪进行细胞活力实验相当通常。它们用于研究不同药物（例如细胞毒性药物）对各种细胞系细胞活力的影响。它们可用于确定引起细胞毒性作用的抗生素所需的最低浓度，这对于使用抗生素标记物生成稳定细胞很有用。在研究细胞凋亡和其他形式的细胞死亡时经常使用它们。在对未固定细胞进行的流式细胞术实验中建议使用活性染料，以将死细胞排除在分析之外。

活细胞和早期凋亡细胞对活性染料是不可渗透的，因为它们具有完整的细胞膜，因此阴性（图 6）。 Annexin V 与早期凋亡细胞外层的磷脂酰丝氨酸结合。膜联蛋白 V 也与死细胞结合，在那里它与存在于外层和内层的磷脂酰丝氨酸池结合，因为它们的细胞膜完整性受损。活性染料能够穿透死细胞ls 并绑定到他们的 DNA。

图 6. 细胞活力和细胞凋亡分析流式细胞术。

贴壁细胞：

去除培养基并用 PBS 洗涤细胞单层

添加解离剂（例如胰蛋白酶)并在37°C孵育5分钟或直至细胞从细胞培养皿中脱离。

加入含血清的培养基或胰蛋白酶抑制剂以灭活解离剂。

将细胞转移到微量离心管。

悬浮细胞：将细胞转移到微量离心管中。

通过离心（300 G，室温下 5 分钟）沉淀细胞。去除培养基并重悬于含有钙离子的 PBS 或 HBSS 中。

注意：膜联蛋白 V 需要钙才能与磷脂相互作用。用钙盐补充缓冲液并避免螯合剂，如 EDTA 或 EGTA。

细胞计数并在每种条件下取 100 万 (106) 个细胞：

未染色的样品 – 用于建立自发荧光水平

用活性染色的样品dye

Sample stained with an annexin V probe

Sample stained with a viability dye and an annexin V probe

注1：Annexin V和a viability dye有具有不同的激发光谱以区分它们的染色。有关多色设计实验的提示，请参阅第 4 节。

注 2：考虑包括阳性对照样品，其中细胞用诱导细胞死亡的试剂处理，以验证所用探针的性能。

加入荧光标记的膜联蛋白 V，并在室温下孵育 15 分钟。

膜联蛋白 V 优先结合磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丝氨酸存在于活细胞质膜的内层。在早期凋亡细胞中，磷脂酰丝氨酸转移到外层，使其易于与膜联蛋白 V 结合。

离心沉淀细胞（300 G，室温 5 分钟）。去除培养基并重悬于 PBS 或 HBSS 中。

添加活力染料（例如碘化丙啶）并在室温下孵育 5-20 分钟。

碘化丙啶 (PI)一种 DNA 嵌入剂——用作与 DNA 结合的荧光染料。死细胞失去细胞膜的完整性，这使得染料能够到达细胞核并与核酸结合。

在流式细胞仪上分析细胞。

注意：请勿在分析前清洗细胞，以免洗掉死细胞中积累的活性染料。

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