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ChromoTek 如何减少自发荧光 |蛋白质科技集团

2025-09-27

博客如何减少自发荧光如何减少自发荧光

了解自发荧光背后的原因以及如何处理这个问题。

免疫荧光 (IF) 是一种流行的基于抗体的技术，用于分析蛋白质在组织和细胞中的表达和分布。与传统显色染色相比，使用 IF 的优势之一是通过利用不同荧光团的不同发射光谱观察同一张幻灯片上的多个目标，可以轻松进行多重染色。 IF 还具有相对较高的灵敏度和较宽的动态范围，允许观察低丰度蛋白质和高表达蛋白质，以及观察蛋白质-蛋白质共定位的能力。然而，IF 的一个伪影是某些样品中存在自发荧光，这通常会掩盖低表达目标或暗淡染料的表达。不幸的是，这使得从幻灯片中的噪音中辨别出特定的染色冷漠。

什么是自发荧光？

自发荧光描述了组织中的背景荧光，这种背景荧光并非由抗原-抗体-荧光团相互作用的特定染色引起。这是由多种原因引起的，并且有一些步骤可以在实验中将其影响降至最低。

交联固定诱导的自发荧光

组织固定的常用方法是使用化学交联剂，例如福尔马林。这些固定剂的作用是在蛋白质之间形成共价键，将它们结合在一起，形成一个不溶性的网状结构来保护组织结构。醛固定的一个不幸后果是醛与胺结合形成席夫碱，导致自发荧光（戊二醛>多聚甲醛>甲醛，PMID：6404984）。

来自这种固定的自发荧光具有广泛的发射光谱，发生在蓝色、绿色和红色光谱范围内（PMID：24722432）。样品的加热和脱水也会增加自发荧光，其在红色光谱中的作用更大。最小化自发荧光的最佳方法是固定样品所需的时间最少。也已使用硼氢化钠处理来最大限度地减少这种情况 (PMID: 9765122)，但由于其影响可变，因此不推荐使用。或者，还有其他可用的固定剂，例如使用冷冻 (-20 °C) 乙醇等有机溶剂，这是一种很好的细胞固定剂。

$\"\"$ $\"\"$ 图 1. 使用绿色（左）和远红色（右）滤光片采集的未染色福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 肾组织的内源性自发荧光。请注意在远红滤光片下背景自发荧光如何不那么明显。内源性色素自发荧光

自发荧光也可能由于组织中的天然化合物而发生。血红素组在红细胞中，由于其多聚蛋白环结构而表现出广泛的自发荧光，这会使分析复杂化 (PMID: 29058770)。最小化这种情况的最佳方法是在固定前用 PBS 灌注。然而，PBS 灌注并不总是适用于某些组织样本，例如尸检或胚胎组织。在某些情况下，通过在低 pH 值下用 CuSO4 和 NH4CL 处理，或用 H2O2 漂白组织，观察到可以成功减少自发荧光。

其他有问题的内源性色素包括胶原蛋白、NADH 和脂褐素。胶原蛋白是一种高表达、普遍存在的结构蛋白，发射光谱在 300-450 nm 左右的蓝色区域 (PMID: 11830520)。 NADH 是一种对新陈代谢中的许多作用必不可少的酶，它在代谢活跃的细胞和组织（例如肝脏）中的含量会增加。 NADH 的发射光谱约为 450 nm（PMID：11830520）。因此，当用高水平化合物（如胶原蛋白和 NADH（发出在蓝/绿光谱中）选择发射光谱在红色和远红色区域的荧光团，例如 CoraLite594 和 CoraLite 647，将有助于区分特定染色和自发荧光。脂褐素是一种颗粒状亲脂性色素，随着年龄的增长，它会在许多组织（包括骨骼肌、神经元和心脏）的溶酶体中积累。脂褐素在整个光谱范围内发出荧光，在 500-695 nm 处最强，因此可能是另一种有问题的化合物，因为它的颗粒状外观可能被误认为是特定染色。为了抵消这些影响，亲脂性染料苏丹黑 B 可以有效消除这种自发荧光（PMID：10330448）。然而，苏丹黑 B 确实在远红通道中发出荧光，这在规划多重染色板时必须考虑。

自发荧光问题总结eshooting

如果自发荧光是您实验中的一个问题，这些一般的带回家的要点可能有望解决一些问题并\"消除”一些光线。

在可能的情况下，使用交联固定剂的替代品或尝试使用多聚甲醛代替戊二醛，并始终固定所需的最短时间。

硼氢化钠可用于（结果不一）减少福尔马林诱导的自发荧光。

在固定前用 PBS 灌注组织以去除红细胞。

苏丹黑 B 和铬黑 T 等化合物可减少脂褐素和福尔马林诱导的自发荧光。

使用发射波长远离样品中自发荧光化合物的荧光团。通常，CoralLite 647 等远红外波长荧光团最适合此目的。

TrueVIEW (VectorLabs) 等市售试剂已被证明可以减少多种原因引起的自发荧光。

始终执行内源性组织控制s（无一抗或二抗）和一抗对照（只有二抗）以揭示免疫荧光实验中的自发荧光和非特异性结合水平。

CoraLite 偶联抗体

直接与间接免疫荧光

CoraLite 直接染色 IF 的优势