原标题：【疫病技术】CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在动物细胞系构建中的应用

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CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在

动物细胞系构建中的应用

一

CRISPR/Cas9的结构和编辑原理

早在上世纪八十年代，日本学者Nakata在大肠杆菌基因组中发现了一系列的短的间隔序列，但其功能一直为迷。随着基因测序技术的发展，人们发现这些重复序列广泛存在于细菌和古细菌基因组中，2002年将其正式命名为CRISPR。直到2008年，CRISPR/Cas9才被证明具有免疫能力，在E.coli中成熟的crRNAs引导形成Cas蛋白复合体，从而抑制病毒的增殖。2012年，由RNA介导的基因组编辑技术CRISPR/Cas9正式开始发展起来，并完成了在哺乳动物细胞中的基因组编辑。

基因编辑技术是通过基因的定点突变，以小片段的删除及目的基因的插入等方式对基因组进行精确修饰的一种技术，是研究基因功能的重要手段。目前，基因编辑技术主要经历了3个不同的研究阶段：锌指核酸酶（ZFNs）是第一代人工核酸内切酶，较传统的基因敲除技术易于操作、效率高、周期短，曾被应用于动物和细胞的定点修饰与基因敲除。但随着基因研究技术的发展，ZFNs技术在实际应用中存在制备繁琐、效能低、成本高的缺点，于是，TALEN技术应运而生。2011年，TALEN技术成功应用于目的基因的编辑，该技术应用简单高效、细胞毒性较小，被广泛应用于动植物细胞、人细胞及斑马鱼等模式生物的研究中，但该技术的靶点模块建立较复杂，耗时较长。直到2013年，Cong和Mali将CRISPR/Cas9系统成功应用于人类和小鼠基因组编辑，这样第三代人工核酸内切酶技术- CRISPR/Cas9技术迅速成为各国学者研究的重点基因编辑技术，并广泛应用于各种模式动物模型和细胞系的建立。

CRISPR/Cas9是存在于大多数细菌和古生菌中的一种获得性免疫系统。由多个重复序列和非重复的间隔序列组成，主要包括R-S结构和编码cas的基因操作子。R-S结构具有特异性识别外源DNA的功能，cas基因家族可编码多功能的CRISPR蛋白，并与成熟的crRNA共同作用构建能够抵御外来病毒入侵的免疫屏障。根据CRISPR/Cas9系统中cas蛋白的不同，将CRISPR/Cas9系统分为I、Ⅱ和III 3种类型。I型和III型CRISPR/Cas9系统需要多个Cas蛋白的参与，Ⅱ型CRISPR/Cas9系统仅需要Cas9蛋白即可对DNA特定位点进行修饰，是目前研究的最彻底、也是应用最为广泛的。

CRISPR/Cas9系统的作用机制主要通过三个阶段实现：获得CRISPR可变间隔序列、转录crRNA前体与加工crDNA、crRNA-tracrRNA-Cas9复合体剪辑外源性DNA。与传统的ZFN、TALEN基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统通过设计不同的RNA向导对基因进行定点修饰，操作简单易行高效，基因修饰可遗传、无物种限制、实验周期较短、成本较低、对细胞毒性较小，适合于多基因、高通量的操作，可应用在各种不同的细胞和模式生物中，且发生同源重组的概率比自然发生同源重组的概率高。

二

CRISPR/Cas9技术在动物细胞系构建中的应用

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究深入和不断完善，该技术已成为动植物基因功能研究和建立动物细胞系和疾病模型的主要手段，尤其在动物细胞系的建立方面起到了重要的作用。CRISPR/Cas9基因编辑技术在动物细胞系中的应用主要包括基因的敲除和插入及基因修饰三个方面。

我国科学家针对猪的酪氨酸酶、PARK2和PINK1基因的外显子设计了Cas9打靶质粒，获得了纯合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2和PINK1双基因敲除的细胞系，该细胞系用于体细胞核移植后，成功培育出酪氨酸酶基因敲除猪和PARK2 和PINK1双基因敲除猪，建立了人类白化病和帕金森综合征两种猪模型，该研究团队首次将CRISPR/Cas9技术与体细胞克隆相结合，实现了大型家禽双基因的等位敲除，这对于人类遗传性疾病的研究有重大意义。近期，又有中国学者通过CRISPR/Cas9 技术成功构建了酪氨酸酶(TYR) 等位基因突变的猪胎儿成纤维细胞系和PARK2和PINK1双基因knock-out的细胞系，成功培养出基因突变的个体，并可稳定遗传给下一代。韩秋影等利用CRISPR/Cas9技术实现了细胞水平的基因敲除技术，同时构建了能稳定表达Cas9蛋白的HEK293细胞，并运用CRISPR/Cas9基因转录激活技术，使得HEK293细胞cGAS基因的转录激活。陈芳等通过sgRNA介导Cas9蛋白对目的基因的靶位点进行特异性切割，经同源重组或非同源末端连接方式进行修复，获得了Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。

WHO统计结果显示，目前世界上有近6000多中疾病与基因发生异常相关，但在临床上仍缺乏有效的治疗体系，由于干细胞具有较强的可塑性和重建能力，因此干细胞基因修饰技术成为构建疾病模型、筛选靶向药物和制备治疗型干细胞的关键技术，也成为了人类基因疾病治疗的新希望。王晔博等利用CRISPR/Cas9系统编辑原理，在人的多功能干细胞WAN基因第6个内含子的高突变位点区域，设计了2个gRNAs，通过IDLV携带模板序列的方法筛选出了同源重组子，其正确率达50%，有效优化了人多功能干细胞中基因编辑效率，为研究发育生物学和某些疾病的机理提供了操作平台。吴福仁等利用Cas9核酸酶在sgRNA介导下可引起基因组DNA双链断裂，从而形成同源重组修复的特性，构建了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系，为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。韩笑等利用gRNA定位，引导Cas9蛋白精确定位进行DNA剪切，并启动DNA自我修复机制，建立了能稳定表达Cas9蛋白的小鼠胚胎干细胞系，实现了多个位点的同时编辑，同时运用Cas9核酸酶在DNA双链上精确剪切DNA，降低了Cas9剪切DNA的脱靶率，有效提高了应用CRISPR/Cas9技术在胚胎干细胞中进行基因编辑的效率。

因此，高效的基因编辑技术和精确的基因操作方法为构建所需的细胞系提供了必要的手段。目前，CRISPR/Cas9技术作为近几年兴起的第三代基因编辑技术，日渐广泛应用于病毒基因组的编辑、细胞系的建立及人类疾病模型的研究等各领域，提供了一种简单高效的基因重组的筛选方法，极大地推动了基因工程技术的应用研究。

三

存在问题

CRISPR/Cas9技术已开发为具有多功能的技术，但在长期的研究应用中发现，CRISPR/Cas9技术在动植物细胞基因改造及其他应用方面存在着脱靶的风险。CRISPR/Cas9系统是通过向导RNA（sgRNA）与目标DNA匹配，从而指导Cas9蛋白与特定基因位点结合并进行剪辑。设计的sgRNA可能与非靶位点的序列结合，导致基因突变，即脱靶效应。最近的研究显示，提高sgRNA的特异性，如通过减少或改变sgRNA与预测位点的碱基对，改造高特异性的Cas9蛋白等手段可降低Cas9基因编辑中的脱靶效应。

另外，CRISPR/Cas9技术是否对动物细胞产生毒性，改造病毒株生产的疫苗是否会引起免疫反应等问题都需要更深入的研究和探讨。因此，结合以上对CRISPR/Cas9系统结构和编辑原理、在动物细胞系建立中的应用及存在的问题等现状的分析，可进一步完善CRISPR/Cas9系统在干细胞中的同源修饰效率以及在造血干细胞中对遗传性P-globing异常疾病的基因治疗等方面的研究。

生产部 葛玉凤 编审 李冬

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猪传染性胃肠炎的诊断与防控

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种急性、密切接触性猪群消化道传染病。该病主要发生在冬春两季，尤其是冬春换季时期更高发，不同品系和年龄段的猪群都能被感染引起发病，10日龄内仔猪感染本病后病死率高达100%，临床特征为腹泻、呕吐和脱水，是各个国家及地区危害养猪业非常严重的一种猪传染病，给各个养殖场造成了巨大的经济损失，同时给食品卫生行业造成了巨大的隐患。

一

TGEV病原学

TGEV属于冠状病毒科、冠状病毒属。基因组形式为不分节段的单股正链RNA，其大小为2.86×104 b，分为7个区，5’端有帽子结构，3’端有Poly A结构。最大的非编码区位于3’端N基因上游，不包括Poly A延长段，大小约为280个核苷酸。第1个基因位于5’端，其大小约为2×103 b，由ORFla和ORF1b组成，编码病毒的复制酶和转录酶。其余6个基因，除基因3有2个ORFs(ORF3a,ORF3b)外，剩余都只有一个开放阅读框(ORF)。其中ORF2编码病毒的纤突蛋白（S蛋白），ORF4、ORF5编码病毒的膜蛋白（M蛋白），ORF6编码病毒的核衣壳蛋白（N蛋白），ORF3a、ORF3b、ORF7编码病毒的非结构蛋白。有文献报道，TGEV基因组容易发生很高的重组几率，跟分阶段的RNA病毒基因组相似。TGEV 在冷冻条件下比较稳定，肠组织内的病毒在-20℃冻存条件下保存半年至一年半测病毒滴度无明显变化，但是此病毒耐热性差，在65℃ 10 min 或56℃ 45 min条件下可全部被灭活。采集的粪便中的病毒放置在4℃条件下可存活存放8 周左右、-20℃条件下可存活14d，37℃条件下放置24 h后仍具有致病性。病毒暴露在光、紫外线下可立即被杀死，对三氯甲烷和去氧胆酸钠比较敏感，低浓度的消毒剂（推荐使用临洮威特公司高端消毒剂产品：威特格瑞）就可杀灭病毒。TGEV在较低的pH环境时（pH4-8）比较稳定，对胰酶有一定的抵御能力，能够耐受0.5%胰蛋白酶作用1 h，但不同毒株对胰酶和蛋白分解酶的耐受性差别较大，TGEV的这种抵抗胰酶和蛋白酶的特性使得病毒能够自我抵抗胃肠的酸环境，使其不断繁殖，造成宿主出现较严重的临床症状。

二

TGEV临床症状

TGEV的潜伏期一般为7-21d左右，发病后常呈急性型，在第一个患病猪出现临床症状后经2-4天即可扩散至整个猪群，由于患猪性别、体重、饲养管理条件等不同，其临床症状也有一定的差异。

1、哺乳仔猪

14日龄内的新生仔猪感染TGEV后，常表现严重的腹泻症状并出现精神差、食欲低下、面色惨白、被毛粗乱、呕吐等症状，排出的稀粪呈黄色或黄绿色，混有未完全消化的豆腐样的食物，散发出浓烈的腥臭味，发病1周后常因为多脏器功能衰竭而死亡。14日龄内仔猪感染TGEV后的病死率可达到60%-100%，14日龄后的仔猪病死率10%-45%，患病猪耐过后常表现出生长缓慢、饲料利用率低。目前，本病还没有任何切实有效的治疗方法，但采取对症治疗。

2、育肥猪

育肥猪感染TGEV后，常出现精神萎靡，食欲低下或不愿进食，体温下降，常排水样稀粪，稀粪呈现喷射状，患病猪因脱水而逐渐消瘦，大便呈反常的黄绿色、灰色和深褐色等，并伴有大量的的气泡和未完全消化的食糜，散发出腥臭味。患病猪通常情况下1周后就可完全康复，不再复发，育肥猪患病后病死率极低。

3、孕产母猪

喂奶母猪患病早期表现出食欲下降，不愿走动，随后出现腹泻或呕吐等症状；极个别病例高热至40-42℃，患病动物严重脱水，消瘦，发展至晚期出现极度虚弱；乳房萎缩，产奶量下降或者完全不分泌乳汁；初生仔猪因严重的缺奶、脱水，造成营养性贫血，绝大多数仔猪在短期内死亡；怀孕母猪感染本病后会出现流产、产木乃伊胎、死胎、弱胎。

三

TGEV病理解剖病变

TGEV主要病变在胃和小肠内。仔猪胃肠道水肿，胃充满未经消化的凝结物，胃黏膜充血，黏膜下层有出血斑点；小肠充斥着黄绿色或灰色液体物质，包含较小气泡和乳汁，小肠壁变薄，肠道扩张，肠系膜淋巴结肿大，肠系膜淋巴管可看到乳汁；肾脂肪变性和白色尿酸盐沉积，或出现肺炎。

四

诊断技术

1、病原学诊断技术利用透射电镜扫描是诊断TGEV的常用方法，通过将样品经磷钨酸负染后进行观察，可以清晰的看见病毒颗粒。其次，将病毒分离培养并提取基因组进行测序分析是最准确的方法。TGEV可以在PK-15细胞、Marc-145细胞、ST细胞等细胞系上增殖并出现明显的细胞病变（CPE），将收集的疑似病料需盲传几代后才会出现CPE,不同的细胞系出现CPE的传代次数也不一样。

2、血清学诊断技术 ①间接免疫荧光技术（IFA） 将收集的病毒接种于细胞或者将病料制作成切片后，进行IFA，此方法早已建立并被广泛使用。②血清中和试验（SN） 通过将病毒接种到细胞上，将血清稀释成不同梯度，同时设置标准阴阳性血清对照进行检测，但SN特异性不高，有可能出现假阳性现象。③酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前诊断各种疫病最常用的诊断技术，主要包括间接ELISA技术、固相竞争ELISA技术、液相阻断ELISA技术等，可以检测抗原或者血清效价，该方法具有准确、快捷、特异性灵敏度高并且稳定等优势。

3、分子生物学诊断技术 主要包括RT-PCR、qRT-PCR、LAMP以及RPA等以病毒cNDA为模板进行扩增的检测技术以及一些利用分子探针进行杂交的检测技术，如：膜杂交、原位杂交等技术。

五

防控

1、加强生物安全防护工作加强圈舍清洁工作，对携带大量病原体的排泄物及时清理，消毒，做好圈舍的通风、温湿度调节等工作，对圈舍周围环境、进出人员及车辆进行严格的消毒处理。加强管理，合理搭配营养，增强猪自身免疫力，坚持自繁自养、同进同出的养殖原则，若需从外面引种时，必须对引进猪进行检疫，以防带入病原体感染整个猪群，造成大的经济损失。

2、疫苗接种 目前，疫苗接种是防控本病的主要手段。主要包括：①强毒疫苗：起初，人们利用病死仔猪的肠组织研磨稀释后饲喂怀孕母猪，通过母源抗体保护新生仔猪，但由于怀孕母猪持续向外排毒，使得该病反复出现，现已被禁止使用。②弱毒疫苗：弱毒疫苗经肌肉注射后刺激机体黏膜免疫，产生快速、高效的抗体，但同样存在着持续感染、毒力增强等风险。③灭活疫苗：可以很好地解决持续感染、毒力返祖等困扰，同时具有安全性强、易于规模化生产、保护率高等优势。目前，已经有商品化的PEDV+TGEV二联苗销售使用。④基因工程疫苗：由于分子生物学的飞猛发展，基因工程疫苗因其具有高安全性、低成本、制造简单等特点被广泛关注，多种基因工程疫苗的研发也取得了长远的进展。其中，TGEV的纤突（S）蛋白为目前科研人员普遍关注的研究靶点。

3、治疗 目前，对本病无有效的治疗措施，主要通过补液的方式调节电解质平衡，其次通过服用抗生素等抗菌药物防止病猪的继发感染。

研发部 张涛 编审 王同淑

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替代基于PCR的核酸检测技术—重组酶聚合酶扩增技术

在上世纪80年代末，Mullis发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），它是一种能从微量的起始模板特异性扩增（体外）目的DNA的方法。由于该技术灵敏度高和特异性强的特点，已被广泛地用于动物疫病的病原检测、分子生物学研究和临床医学等领域。2006年，英国TwistDx Inc公司首次研发出重组聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），它是由重组酶介导的，模拟生物体内DNA复制，并且在常温下即可对目标片段进行等温扩增，被认为是可以替代PCR的核酸检测技术。截至2017底，在PubMed中已有将近100文献报道了其在病原检测的应用。由于最低的样品制备要求、低操作温度（25°C～42°C）以及商业上可获得的冻干试剂，RPA已在实验室环境以外的偏远地区应用，并且正在成为快速、特异和经济有效地鉴定病原的分子工具。

一

RPA如何工作？

RPA由2个关键蛋白组成，用于替代PCR中常见的热变性步骤：大肠杆菌RecA重组酶和单链DNA结合蛋白（single-strand DNAbinding protein，SSB）。通过具有延伸引物所需的链置换活性的DNA聚合酶进行复制。目前的商业化试剂盒使用来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SauDNA聚合酶。辅助蛋白和辅因子也支持RPA反应过程，如T4 UvsY蛋白，它是在核蛋白丝形成过程中辅助RecA重组酶的装载因子。聚乙二醇是一种高分子量的大分子，通过充当拥挤剂来刺激RPA关键蛋白与DNA的相互作用。磷酸肌酸在肌酸激酶作用下产生ATP并为反应提供能量。这些组合物用于典型的RPA试剂盒中，但某些组分也可替代，例如RecA可被T4 UvsX蛋白替代、SSB蛋白可被T4 gp32替代，Sau聚合酶可被Bsu聚合酶替换和聚乙二醇可替代为Carbowax20M。

在RPA中，重组酶与引物和探针形成核蛋白微丝，微丝开始寻找同源序列的靶DNA，一旦发现同源性，微丝就会进入双链DNA，形成一个D环结构，这是一个DNA链的局部分离，其中互补链被SSB稳定，目标链与引物杂交（图1）。重组酶水解ATP，诱导核蛋白丝解离重组酶，通过链置换DNA聚合酶使引物延伸。新产生的DNA用于另一轮RPA。因此，通过重复RPA循环来实现指数扩增，RPA循环可一直进行，直到磷酸肌酸耗竭。

图1 RPA扩增原理图（引自Boyle et al, 2014

通常，RPA反应仅需在37℃～42℃反应5～20分钟，但这取决于起始模板拷贝数和扩增子大小。另外，可以通过将逆转录酶加入RPA试剂组分来扩增RNA。一步法逆转录酶RPA（RT-RPA）可在单一温度下运行（40℃～42°C），并且能在20分钟内进行检测。

二

RPA引物和探针的设计和功能

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，PCR引物多半是不适用的。根据TwistDx Inc公司关于RPA引物和探针设计的指导原则：

（1）RPA引物大小为30～35个碱基，以便更好的形成重组酶/引物。不推荐使用更长的引物（＞45个碱基），这可能会产生引物二聚体或抑制反应的进行。

（2）必须避免GC含量低或高（＜30％，＞70％）。

（3）引物5’端的3～5 bp应当避免出现G，而C可能有助于重组酶－引物复合物的形成。

（4）3’端最后3 bp出现G和C有利于反应的进行，这可能与聚合酶结合有关。

（5）探针的长度在46～52 bp之间，由三部分组成：5’端至少为30 bp作为引物的基本部分、四氢呋喃脱碱基位点（tetrahydrofuran abasic-site mimic，THF）、3’端为15 bp，在其5’端标记FAM，3’端用阻断聚合酶扩增的基团修饰（如C3-spacer）。引物的3’端用生物素标记。大肠杆菌核酸外切酶nfo可以识别THF位点并切开磷酸二酯键，产生自由的羟基端，探针DNA便在聚合酶作用下进行延伸。

RPA可以扩增高达1.5 kb的序列。然而，用较短的扩增子可获得更好的结果，如在80～400bp范围内（100～200bp最佳）。此外，RPA引物和探针没有对解链温度要求，因为引物退火和延伸是酶介导的而不是温度驱动的。

三

RPA检测类型

3.1 普通RPA

将RPA反应体系在37℃～39℃孵育10～20分钟，然后在琼脂糖凝胶电泳检测产物。由于RPA体系中能影响DNA在脂糖凝胶的迁移率，导致电泳结果出现抹带，因此扩增产物一般需要纯化后进行电泳检测。Rohrman等建立了检测HIV的RPA方法，灵敏度低至10拷贝。

3.2 荧光定量RPA

将RPA基础体系、专用的exo探针技术和核酸外切酶III结合起来（TwistAmp®exo试剂盒），如同荧光定量PCR，既可以实现目的基因的检测，也可以实现目的基因拷贝数的实时读取，进而可以进行动力学分析。

3.3 LFD-RPA

将RPA与横向流动试纸条技术（Lateral flow dipstick，LFD）相结合，可达到快速终点检测的目的。LFD-RPA原理是当由羧基荧光素（FAM）标记的探针与与生物素（Biotin）标记的核酸扩增产物特异性结合，将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成三元复合物，当扩散到检测线时，三元复合物被生物素配体捕获，形成检测线；未杂交的FAM标记探针与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成不含生物素的两元复合物，结合在质控线上（图2）。LFD-RPA的优点是经过39℃的作用10～20min，肉眼可在试纸条观测到结果，不需要复杂的仪器设备，特别适用于经济欠发达地区的现场快速检测。

图2 LFD-RPA原理图（引自Shim et al, 2013）

四

与其他核酸扩增技术的比较

目前应用最为广泛的恒温扩增技术主要是环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。恒温扩增技术相对于PCR技术具有高特异性、高敏感度、操作简便和不需特殊仪器等优点。RPA反应试剂可以以冻干形式保存，因此便于运输及保存，操作简单仅需要向反应体系中加入样品模板及引物、探针等液体组分即可进行反应。RPA技术与其他恒温扩增技术相比见表1。

表1RPA技术与其他恒温扩增技术相比

五

展望

RPA的低操作温度（接近体温）及其最低的样品制备要求，可对多种生物样品（例如血清，粪便，尿，食物，植物和动物组织）进行测定，且该技术在基层临床检测和快速诊断方面具有明显的优势。虽然该技术取得了一定的进展，但目前的RPA检测成本高于PCR等其他核酸扩增技术，相信随着RPA技术的进一步发展、完善及生产工艺的改进，RPA技术有望成为常规的快速诊断手段，并在分子生物学、医学、遗传学等其他领域取得更广阔的应用前景。

研发部 王会宝 编审 祁光宇返回搜狐，查看更多

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