基 于 γ-2松猴 疱 疹 病 毒 （HVS) 的载体一构建基于 H V S 的重组载体
构建基于HVS的重组载体材料细胞：ElectromaxDHlOB细胞（Invitrogen);OMK细胞 氯霉素（50ull/ml) DMEM补充如下物质： 2mmol/L谷氨酰胺 0.1%(m/V)碳酸氢钠 200U/ml青霉素 200U/ml链霉素 胎牛血清（FBS) 葡萄糖（20%和40%m/V)溶于PBS中 以孔径为0.2um的滤膜过滤。 卡那霉素（25ul/ml) Lipofectamine2000(Invitrogen) LB培养基（pH7.5) 1%(m/V)蛋白胨 0.5%(m/V)酵母提取物 0.5%(m/v)氯化钠 氯化镁（l〇mmol/L) PBS缓冲液 质粒：HVS——BAC和pHVS^Shuttle QIAquick凝胶回收试剂盒 病毒悬浮缓冲液 100mmoI/LTris-HCl(pH8.0) 50mmol/LNACl 10mmol/LEDTA 仪器 BeckmanSW27离心机 烧瓶（75cm3) 梯度混合器 LB琼脂培养平板(14cm) Maxiprep柱（QIAGEN) 滚瓶 方法 1•将外源基因表达片段（包含合适的启动子、基因片段、多聚腺苷酸化信号）插入到穿梭质粒pHVS——Shuttle中。 2.用I-Pp0I酶切，将这个基因的表达框和卡那霉素抗性基因片段从pHVS——Shuttle上分离出来。 I-PpoI酶切反应是在加入IXBSA和10mmol/LMgCl2的lXI-PpoI酶切缓冲液中进行。 3.依照产商说明书，用QIAquick凝胶回收试剂盒纯化目的片段。 4.用5〜IOul的1-PpoI酶切使得HVS^BAC线性化。 5.65°C处理20min,热失活对穿梭质粒和HVS^BAC的酶切。 6•将HVS^BAC的酶切产物在蒸馏水（dH20)中透析2h。 7.连接线性化的HV&BAC和穿梭质粒片段，标准条件下16°C连接过夜。 3ul的HVS^BAC与IfI的穿梭质粒酶切片段，在IOfJ的连接体系中进行连接，按照这样的比例通常可以得到较好的结果。具体的量可以根据提纯的DNA的质量和数量而定。 8.将连接产物在蒸馏水（dH20)中透析2h。 9•用电穿孔法将无盐的连接产物导人到20ul的ElectromaxDHlOB菌体中。 10.加人400W的LB培养液，使菌体复苏。 11.37°C下，摇晃（lOOr/min)孵育lh。 12.将电转导后的细胞涂在含有LB琼脂培养基、卡那霉素（50ug/ml)和氯霉素(25ug/ml)的平板（直径Mcm)上，过夜。 I3•按照产商提供的低拷贝质粒的提取方法，用Maxiprep柱从形成的菌落中提取和纯化重组的HVS^BACDNA。 14.按照产商说明，用Lipofectamine2000将2哗的纯化HVS——BACDNA转人到OMK细胞中。 15•将转染后的细胞在DMEM培养基中孵育4〜5d，直至出现明显的细胞毒性。 16•使子代病毒释放到胞外的培养液中。 病毒工作储存液的生长 最适于HVS病毒裂解感染和生长的细胞系是在含有1〇%FBS的DMEM培养基中培养的OMK细胞。 17•将IXlO7个细胞接种于75cm3的细胞培养瓶中，使细胞生长至汇合。 18.在5ml含有2%FBS的DMEM培养基中，以每个细胞〇.1个蚀斑形成单位(0•lpfu/cell)的感染复数感染细胞。 19.在37°C感染Ih后，吸出培养液。 20.加人IOml含有5%FBS的DMEM培养基，在37°C下培养4〜5d。 21.当观察到出现细胞毒性时，释放子代病毒到胞外的培养液中。HVS的工作储存液可以2X10s——2X107pfu/ml的最终浓度，在一70℃下长期保存。如仅需中期保存，HVS能在4°C保持稳定。 高滴度病毒的生长和纯化 22.将约2X108个OMK细胞接种于滚瓶中，用含有10%FBS的DMEM培养基培养。 23•以约0.5pfu/个细胞的感染复数感染细胞。孵育4〜5d。 24•分离细胞，收集细胞培养液。 25.用带BeckmanSW27转头的离心机，4°C下，将悬浮液于20000r/min离心90min。 26•用病毒重悬缓冲液将沉淀重悬，每两个转瓶约使用3ml的重悬缓冲液。4°C下过夜。 27.用梯度混合器，准备20%〜40%的葡萄糖浓度梯度。在浓度梯度中使重悬的病毒分层。 28•用带BeckmanSW27转头的离心机，4°C下，于20OOOr/min离心30min。 29•收获中间的条带，这条带中包含约90%的包装的病毒颗粒。 30•用带BeckmanSW27转头的离心机，4°C下，于25OOOr/min离心60min。用PBS重悬沉淀。 |
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