用 于 DNA传递的阳离子多糖实验一阳离子多糖的合成及体外转染
阳离子多糖的合成及体外转染材料试剂 联辛可宁酸（BCA)试剂盒（Pierce) (3-galELISA试剂盒（Roche)或(3-gal检测试剂盒（Invitrogen) 磷酸钙试剂（Sigma-Aldrich) 待转染细胞，如 C3H10T1/2 HEK293 CHO HeLa NIH3T3 EPC COS-7 葡聚糖（平均分子质量40kDa)(Sigma-Aldrich) 胎牛血清（FBS)(BeitHaemek,Israel) 谷氨酷胺（4nmol/L)(BeitHaemek，Israel) HEPES■缓冲生理盐水（HBS;150mmol/LNaCl，20nmol/LHEPES，pH7.1) 用0.2um膜过滤除菌或高压灭菌于4°C保存。 人生长激素（hGH)ELISA试剂盒（Roche) 盐酸羟胺 磷脂配方 DOTAP/Chol1/1(AvantiPolarLipidsInc.,Alabama) Transfast(Promega) FuGENE6(Roche) 萤光素酶报道基因检测试剂（Roche)或萤光素酶检测试剂盒（Promega) 完全培养基：DMEM，含10%(m/m)胎牛血清（FBS)、0.2mmoI/LL-谷氨酰胺、lmg/ml青霉素，IOOUAnl链霉素DMEM(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium) 氮气（储存复合物用） 青霉素（BeitHaemek，Israel) 质粒 pEGFP-Cl,CMV启动子；pLNCluc质粒，含萤火虫萤光素酶基因；pLacZ,SV40或CMV启动子；pCMVhGH用于定量及定性分析。使用NucleobondAX500柱（Machery-Nagel，Duren，Germany)或QiagenPlasmidMegaKit(Hilden，Gerimany)纯化质粒。DNA的浓度通过磷的含量确定，磷含量代表了DNA负电荷的量。 高碘酸钾（KIO4)(Sigma-Aldrich) 硼氢化钠（NaBH4)(Sigma-Aldrich) 精胺（Sigma-Aldrich) 链霉素（BeitHaemek，Israel) 仪器 纤维素透析管（截留分子质量3500) 6孔细胞培养板 Dowex-I(醋酸盐型）阳离子交换树脂 突光显微镜（ModelAxiovert35，Zeiss,Jena,Germany) 冻干机 分光光度计，NMR(核磁共振波谱仪），红外 方法 阳离子多糖的合成：葡聚糖的氧化 1•将葡聚糖（l〇g，62.5mm〇l糖单元）溶于200ml二次去离子水中。 2.以I:1的摩尔比（糖单元/IO4-)加入高碘酸钾，室温下避光搅拌6〜8h。 3.通过Dowex-1离子交换柱除去IOr及未反应的IOr，纯化聚醛。再用二次去离子水4°C透析（纤维素透析管，截留分子质量3500)3d。 4.冻干纯化后的聚醛衍生物。产物为白色粉末。 平均产率为70%。FT-IR(KBr)在1724cm-1观察到C=O吸收峰。 5.通过羟氨盐酸盐滴定测定聚醛含量（ZhaoandHeindel1991)。寡胺键合 6•将氧化后的葡聚糖（lg，0.75〜6.56mmol醛基）溶于IOOml二次去离子水中。将其缓慢滴加到50ml含有50%过量精胺的硼酸盐缓冲溶液中。 7.室温下搅拌24h。加人NaBH4(lg，4倍醛基摩尔数），将亚胺还原成胺。继续搅拌48h。 8•另用NaBH4(lg，4倍醛基摩尔数），反应24h,重复还原。 9•将亮黄色溶液转移到透析管中（纤维素透析管，截留分子质量3500)，用二次去离子水4°C透析3d。 1〇•冻干透析产物，氮气条件下储存。平均产率为50%(OT/m)。通过对产物的核磁共振分析得到产物的氨基比例。（m)多重峰，（H)质子氢。 细胞数除以视野内的总细胞数计算转染效率（转染百分比)。在有些情况下，基因表达可以用标准BCA试剂盒检测蛋白总量，对结果归一化 展开 |
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