公司旨在为客户提供高质量的实验外包服务（CRO服务），包括实验方案设计，常规基因工程实验操作，重组蛋白表达与纯化，重组抗体制备，天然蛋白分离与纯化，病毒分离培养等免疫学相关技术服务；同时我们也为工业客户提供部分IVD级别抗体和抗原原料。核心平台：---噬菌体抗体展示技术平台苏州蚂蚁淘生物科技有限公司利用自有的噬菌体（M13，T7噬菌体）展示技术平台，能够为客户提供极具性价比的重组Vhh抗体（纳米抗体/驼类纳米抗体）制备方案，包括动物免疫，文库建立，文库筛选以及重组抗体的体外表达等。---抗体工程技术平台卡梅德生物科技的抗体工程平台包含单克隆抗体制备服务平台，多克隆抗体制备服务平台，抗体测序与改造平台。单克隆抗体制备平台：基于杂交瘤技术的小鼠单抗技术平台，最快能够在2-3个月获得高亲和力与高特异性的单克隆抗体，同时基于噬菌体展示技术，我司能够制备多物种的重组单克隆抗体，包括小鼠，兔子，骆驼，羊驼以及人单抗。多克隆抗体制备服务平台：能够为客户提供兔多抗，羊多抗，骆驼类多抗，牛多抗等多物种的抗体制备服务，根据不同的抗原类型，来自蚂蚁淘生物的资深抗体专家会为您量身定做适合您需求的方案，以满足您的项目要求并节省您的宝贵时间。抗体一级序列测序平台：为满足大量客户对抗体基因序列与氨基酸序列信息的需求，我们为客户提供De Novo抗体全长氨基酸序列解析和N端测序服务；同时我们设计积累多达80种杂交瘤抗体基因测序引物。抗体改造技术平台：蚂蚁淘生物技术的抗体改造平台包括嵌合抗体制备，抗体亲和力成熟以及抗体人源化服务。目前我们已经成功制备十几例嵌合抗体与人源化抗体，均成功交付。---蛋白表达与纯化服务技术平台蚂蚁淘生物科技目前拥有四大蛋白表达平台，能为客户提供全面且优质的蛋白表达技术服务。哺乳动物表达平台：目前公司拥有Freestyle CHO，Expi CHO，CHO-DG44，HEK293F，Vero等细胞系用于蛋白表达制备。公司秉承质量优先原则，全部统一采用Gibco细胞培养基和相关转染配套试剂，以保证每个批次的哺乳动物细胞蛋白表达产品高质量、高表达水平的交付。同时公司拥有的表达载体体系，远高于市面常用蛋白表达载体，能够为客户提供高纯度蛋白。昆虫细胞表达平台：目前公司常采用的昆虫表达细胞为SF9，配套使用的是来自Gibco的培养基，只...

一种直接定量检测循环m i RNA的RT-qPCR方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种不需提取核酸，直接定量检测循环miRNA 的RT-qPCR方法。

背景技术

[0002] MicroRNA (miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线 虫等真核生物中。miRNA通过与祀mRNA的3’端非翻译区（3’ -UTR)结合，降解祀mRNA或者阻止 其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。功能上，miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、 凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA表达被精细调控，具有严格的时空特异性。 研究发现，血液中存在着循环miRNA且非常稳定，更为重要是，循环miRNA的异常与许多疾病 的发生发展密切相关，可作为癌症等重大疾病早期诊断和预后评估的新型生物标记物。

[0003] 长期以来，基于实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的检测技术一直都被认为是最灵敏的 miRNA检测手段之一，比较常用的有poly (A)加尾法（Shi R，Biotechnique · 2005，39 (4): 519-525)和茎环引物（Stem loop)法（Chen C，Nucleic Acids Res.2005,33 (20): 1-9)。 Poly⑷加尾法是利用poly⑷聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly⑷尾巴，然后用含有 Olig0 (dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，因此Poly㈧加尾法在降低检 测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个 茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA3’端配对的特异性碱基，可以特异性的进行逆转录反 应。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂 贵，此外，依赖于6个匹配碱基在结合力度方面显然是不够的，会显著降低cDNA合成的效率。

[0004] Kang K等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly⑴法，分别在其专利申请 CN102154505A (在该专利中称为S-S-Oligo (dT)法，所用引物称为S-S-Oligo (dT)引物)和文 章(Kang，K，PloS one.2012.7，e48536.)中进行了公开。在S-Poly⑴方法中，所用引物从5’ 端开始依次是14-20个碱基的PCR通用引物序列，14-20个碱基的通用探针序列，8-30个dT及 与目的miRNA分子的3’端3-8个核苷酸互补配对的特异性序列。与poly㈧加尾法和茎环引 物法相比，S-Poly (T)方法的特异性和灵敏度都大大提高，灵敏度至少提高10倍以上。在升 级版的S-Poly⑴Plus方法中（专利申请号:201510558101.5)，miRNA的Poly㈧加尾和逆转 录一步反应完成，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly⑴Plus技术又有进一步改 进和提高，其总体灵敏度比S-Poly (T)方法提高2-8倍。

[0005] 现有miRNA检测方法都是基于纯化的RNA为模板，由于提取核酸中RNA沉淀和回收 的不完全，将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外，RNA提取过程费时，易造成污染和降解。

[0006] 可见，现有技术还有待完善。

发明内容

[0007] 鉴于此，有必要针对上述问题提供一种不需提取核酸，更为简便、灵敏、高效、廉价 的直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，称之为Direct S-Poly (T) Plus (DSPP)。

[0008] 为了实现上述发明目的，本发明包含以下技术方案：

[0009] 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，所述方法不需提纯核酸，将miRNA从 蛋白复合体中裂解出来，直接进行RT-qPCR检测。

[0010] 进一步的，所述直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法，包含以下步骤：

[0011] S1、裂解离心：利用裂解用试剂将样本中的蛋白复合体中充分裂解，使miRNA从样 本中的蛋白复合体中释放出来;将所得的混合物离心，得上清即为粗提RNA，40u 1的混合物 可以吸取约35ul上清；

[0012] S2、加尾逆转录:将所述步骤Sl中所获得粗提RNA进行加Poly (A)尾及S-Poly⑴特 异性逆转录；

[0013] S3、RT-qPCR定量检测：以步骤S2中获得的逆转录产物cDNA为模板进行RT-qPCR定 量检测。

[0014] 进一步的，所述步骤Sl中所述样本用量为20〜50ul。

[0015] 进一步的，所述步骤Sl中裂解用试剂包括组分:20ul 2Xlysis buffer、lul蛋白 酶K，所述裂解用试剂对应处理20ul样本。

[0016] 进一步的，所述2 X lysis buffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、 300mmol/lNaCl、20mmol/lMgCl2;pHS8.0。

[0017] 进一步的，所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0018] 进一步的，所述裂解条件为50°C处理20分钟，然后95°C保持5分钟。

[0019] 进一步的，所述步骤Sl中的离心条件为：10,000〜14,000g，4°C条件下离心5〜15 分钟;优选13，OOOg，4°C条件下离心5分钟。

[0020] 进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录的反应体系包含多聚腺苷酸聚合酶(polyA polymerase)和逆车专录酉每（reverse transcriptase) 〇

[0021] 进一步的，所述步骤S2中加尾逆转录反应体系中所加入粗提RNA模板的体积百分 比为5〜75%，优选40 %。

[0022] 进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含:0.5-7.5uL上清模板、1 ±0.2yL的0.5 ymol/L RT primer、l±0.2U的PolyA Polymerase、100±20U的MMLV、2.375-0.625uL的 reaction buffer、RNase_free Water补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37〜42°C保 温50〜70min，74〜76°C保温3〜7min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0023] 进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：4uL上清模板，IyL的0.5μΜ RT primer，IU的PoIyA Polymerase，100U的MMLV，1·5yL的reaction buffer，RNase-free Water补足至IOyL;加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保温 5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0024] 进一步的，所述步骤S3中以cDNA为模板进行real-time PCR定量检测，此过程使用 的DNA聚合酶为热启动酶，目的是减少非特异性扩增;real-time PCR反应体系为:4XqPCR reaction Buffer:5yL、lymol/L Forward Primer 4yL、10ymol/L universal reverse primerO.10ymol/L universal Taqman probe0.5yL、100XROX Rerference DyeO.2μ L、hotstart Alpha Taq PolymeraseO.0125yL、cDNA0.5yL、RNase_free Water加至20yL;反 应条件为:预变性95 °C 5分钟，变性95 °C I Os，退火60 °C 40s，40个循环。

[0025] 进一步的，所述热启动酶的制备方法为:将DNA聚合酶和热启动抗体等体积混合， 室温放置6小时。

[0026] 进一步的，所述样本包括血清、血浆/血清、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽 提上清;优选样本为血浆。

[0027] 本发明有益效果：

[0028] 1、本发明Direct S-Poly (T) Plus方法中，不需要提取核酸的步骤，定量检测 miRNA，其流程图如图1所示。操作简便，缩短时间，制备cDNA的时间至少减少70 %以上，简便 性优于传统方法。

[0029] 2、本发明Direct S-Poly⑴Plus方法在逆转录这一步对于模板量要求范围更宽， 5%-75%的粗提RNA均可满足逆转录要求，转录效率优于传统方法。

[0030] 3、本发明中的技术体系尤其适合于从m i RNA丰度较低的生物体液样本中检测 miRNA。本发明方法的灵敏性显著高于传统方法。比如灵敏性方面，20ul的体液样本就可以 实现175个miRNA的检测。

[0031] 4、本发明Direct S-Poly (T) Plus方法能从包括血清、血浆/血清、尿液、乳汁、唾 液、痰液、粪便抽提上清及细胞培养液等生物体液样本中高效检测miRNA，检测效率比传统 方法高出一个数量级，从而提高了体液miRNA定量检测的灵敏性和准确性。

[0032] 5、本发明的简便性、灵敏性和特异性使其在疾病早期筛查和预后评估等研究方面 有重要应用前景，可广泛用于肿瘤、心血管病或其它重大疾病的早期无创筛查。

附图说明

[0033] 图1为miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测流程(Direct S-Poly⑴Plus)。其中，在加 尾逆转录体系中，4u 1粗提RNA作为模板为最优方案。

[0034] 图2为Direct S-Poly⑴Plus方法中不同裂解方案的效果比较。

[0035]图3为Direct S-Poly (T) Plus方法中一步法(加尾和逆转录反应一步完成)和两步 法(先加尾后进行逆转录反应)的差别。

[0036] 图4为Direct S-Poly⑴Plus方法中起始粗提RNA加入比例。

[0037] 图5用Direct S-Poly (T) Plus比较同一志愿者的血清血浆中miRNA表达量。***P〈0 · 001 〇

[0038] 图6以提取的RNA为模板，用S-Poly (T) Plus方法比较同一志愿者血清和血浆中 miRNA的表达量。用miR-cel-54做归一化内参，*#P〈0.001。

[0039] 图7为热启动Alpha Taq Polymerase对Direct S-Poly⑴Plus方法中非特异性扩 增减少作用。

[0040] 图8为hsa-miR-15b_5p扩增曲线，-RT :不加逆转录酶的阴性对照，检测方法为 Direct S-Poly⑴Plus。

[0041] 图9为热启动Alpha taq polymerase用量对miRNA检测Ct值的影响（20ul体系），检 测方法为Direct S-Poly (T) Plus。

[0042] 图 10为使用0.4ul Hotstart Alpha Taq Polymerase miRNA的阴性对照（不加逆 转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为Direct S-Poly⑴Plus。

[0043] 图 11 为使用0.0125ul Hotstart Alpha taq Polymerase miRNA的阴性对照（不加 逆转录酶)扩增曲线(20ul体系），检测方法为Direct S-Poly⑴Plus。

[0044] 图12为Direct S-Poly⑴Plus方法的灵敏度和线性范围。

[0045] 图13为三种miRNA检测方法灵敏度比较。

[0046] 图14为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为 Direct S-Poly ⑴ Plus。数据为土 SE，**P〈0 · 01，***P〈0 · 001，ns，不显著。

[0047] 图15为六个在结直肠癌初筛中显著变化的miRNA单个样本验证。验证方法为S-Poly ⑴ Plus (内参为miR-cel-54)。数据为土 SE，**P〈0 · 01，***P〈0 · 001，ns，不显著。

具体实施方式

[0048] 为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结 合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施 例及其组合实施方式。

[0049] 如无特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市场销售，所采用的方 法均为常规方法，其中引物、探针来自美国Integrated DNA Technologies (IDT)公司。

[0050] 本申请中主要材料来源如下：

[0051] 血液来源于深圳市人民医院和北京大学深圳医院。血浆收集流程为:采血于含有EDTA 抗凝剂的采血管，4°C，3，000转离心10分钟，上清即为血浆;全血样本室温放置1小时，取血清4 °C，3，000转离心10分钟，上清即为血清。血清/血浆样本分装为20-50ul的体系，保存于-80 °C。

[0052] miRNA直接RT-qPCR荧光定量检测方法(Direct S-Poly (T) Plus)最优方案流程如 图1。在最优的方案中，20ul的血浆可以制备35ul粗提RNA，对应87.5ul cDNA。按照20ul qPCR体 系加入0.5ulcDNA，平均可以检测175个miRNA。忽略操作时间，整个miRNA检测流程只需140分钟。

[0053] 实施例I Direct S-Poly⑴Plus方法比较血浆和血清中的循环miRNA含量

[0054] 在本实施例中，同一志愿者血清和血浆同时作为模板，共收集了同一健康志愿者 的血清和血浆样本10对。用本发明中DirectS-Poly (T) Plus方法分别检测等量血清或者血 浆样本中的miRNA表达量。具体包含以下步骤：

[0055] Sl、裂解离心，具体步骤为：

[0056] I) 20uL血楽_/血清与20uL 2X lysis buffer混合均勾，加入IuL蛋白酶K，50°C处理 20分钟，然后95 °C保持5分钟，置于冰上；

[0057] 2)13,00(^，4°(：离心5分钟；吸取上清液(粗提1?熟)转移至另一新的离心管中或直 接用于S2;

[0058] S2、加尾逆转录:miRNA加Poly (A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成）在一个反应体 系中进行，利用S-Poly⑴引物进行miRNA的逆转录。

[0059] 所述2 X lysis buffer包含以下终浓度的组分：100mmol/lTris-HCl、300mmol/l NaCl、20mmol/l MgCl2; pH为8 · 0;所述蛋白酶K的终浓度为15U/mL。

[0060] 加尾逆转录的反应体系包含：4uL粗提RNA，lyL的0.05μΜ RT primer (逆转录引 物），IU的PolyA Polymerase (多聚腺苷酸聚合_，100U的MMLV (鼠白血病逆转录_，1 · 5yL 的reaction buffer (反应缓冲液），RNase_free Water (无RNA酶水）补足至10yL。所述 reaction buffer包含以下终浓度的组分：200mM Tris_HCl，600mM NaCl，40mM MgCl2,4mM ATP，2mM dNTP，pH 8.0。加尾逆转录的反应条件为：37°C保温30min，42°C保温30min，75°C保 温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。

[0061] 所述S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5’端到3’端依次为：14-20个碱基的 PCR通用引物序列、14-20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5-7个与miRNA 3’配对的 特异性碱基。更优选地，所述S-Poly⑴引物序列从5’端到3’端依次为：16个碱基的PCR通用 引物序列、17个碱基的通用探针序列、11个oligo (dT)和6个与miRNA 3’配对的特异性碱基。 [0062] 本发明中所检测的miRNA的序列来自于miRBase，根据各自序列设计不同的S-Poly ⑴引物、上游引物，检测不同miRNA的S-Poly⑴引物序列如表1所示。

[0063]表1、本发明中所使用的引物和探针

[0066] S3、PCR:以步骤S2中逆转录获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下 游通用引物进行real-time PCR定量检测。所述miRNA特异上游引物是不含3’端3-8个碱基 的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Poly⑴引物的14-20个碱基的通用 引物序列。

一、Klentaq1 / Klentaq LA?实例1：用Kelntaq LA扩增大于20kb的大片段基因。?

?

二、高耐受性(Inhibitor-Resistant) 聚合酶：OmniTaq / Omni Klentaq产品特征：1. 对全血、血清、血浆、土壤、植物、巧克力、奶酪和牛奶中的抑制因子具极高的耐受性，可直接对样品进行PCR检测，无需进行DNA分离纯化。2. 可以耐受高达40% 的全血，20% 的血浆或血清，已应用于多种遗传病的分子诊断和临床检验。3. 可用于法医、环境监测、农业、动植物检疫和临床诊断等领域。4. 可以从人血液中一步扩增疟疾基因。5. 与PCR增强剂结合使用时，其耐受性将进一步提高。6. 使用Omni 酶不仅节省时间、降低成本，而且实现了从微量样品中的扩增，避免因提取过程所致的DNA丢失或污染。

实例 2：用OmniTaq（OT） 和 Omni Klentaq（OKT）从肝素抗凝血液中一步扩增乙肝病毒基因。?

实例 3：用新突变的Omni酶从富含腐殖酸的人基因组中扩增1.1kb的CCR5基因。?

实例 4：用新突变的Omni酶从巧克力和黑胡椒中直接扩增基因。

?三、热启动聚合酶(Hot-start) 聚合酶：Cesium Taq / Cesium Klentaq产品特征：1. Cesium Taq 和Cesium Klentaq是一种冷敏感的突变体，在室温条件下聚合酶的活性很低，当升高温度进入PCR循环时聚合酶的活性就全部释放出来，因而具有内置式热启动功能。2. 与现有化学修饰或抗体封阻的热启动聚合酶相比，Cesium Taq 和Cesium Klentaq的聚合酶活性更高，扩增效果更好。3. Cesium Klentaq具有热启动和高耐受性双重效果。

实例 5：用Cesium Klentaq扩增基因热启动效果比较

?四、PCR增强剂（PCR enhancing cocktails, PEC）产品特征：1. 联合使用PEC-1 或 PEC-2与高耐受性Taq酶（OmniTaq and Omni Klentaq）可以更好的克服样品中各种物质对PCR反应的抑制作用，进一步提高PCR扩增效率，简化PCR操作流程提高。2. PEC有助于从基因组中扩增GC含量高达80%的基因。3. PEC也可用于qPCR（SYBR和Taqman probe）。4. 新研发的PCR增强剂PEC-3 and PEC-4有助于从食品中扩增基因。

?

实例 6：联合使用Omni Taq or Omni Klentaq及PCR增强剂（PEC）从不同类型的牛奶中检测沙门氏杆菌 Inv 基因。?

?

实例 7：联合使用Omni Taq or Omni Klentaq及PCR增强剂（PEC）从人的基因组DNA或全血中直接扩增3个高GC含量的基因。?

五、各种特异性一步PCR试剂盒VitaNavi Tech公司开发了系列一步法PCR和qPCR试剂盒，可以直接从样品中扩增目的基因。

1. Direct Blood PCR Kit： 从血液中直接扩增目的基因

实例 8：使用Direct Blood PCR Kit从全血中一步扩增CCR5基因

一步PCR——基因扩增技术的新革命

VitaNavi Technology公司?www.vitanavitech.com

?????? PCR技术已广泛应用于遗传病分子诊断、临床检验、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物检测和亲子鉴定等众多领域。由于血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白、腐植酸等，对常规Taq DNA聚合酶将产生明显的抑制作用。因此，必须先从这些待测样本分离提取核酸，然后用于PCR扩增。显然，传统方法操作步骤多、成本高、对样品的需要量较大且易于造成交叉污染。美国VitaNavi Technology 公司研发的新型高耐受性DNA聚合酶为基因检测技术带来了根本性的革新，彻底解决了依赖于纯化的核酸DNA为模板进行PCR扩增这一瓶颈问题。???????VitaNaviTechnolog是总部在美国的一家专门从事Taq酶及其相关产品研发与销售的国际高科技生物公司。该公司生产的新一代突变的Taq和Klentaq酶可耐受反应中高浓度的抑制因子，具有内在热启动特性，不需抗体或化学修饰。生产的PCR增强剂可改善PCR的结果, 从GC含量>80% 的样品中成功扩增目的基因。 该公司产品被广泛应用于临床诊断，法医鉴定，动、植物检疫，食品及环境监测，畅销全球40多个国家和地区，是目前国际上生产PCR聚合酶的主要供应商之一。

????????? 2012年12月VitaNavi Tech公司授权\"深圳市盎然生物科技有限公司”为其在中国大陆及香港地区的合法代理商，经营所有VitaNavi Tech公司的产品。?

?

核心产品介绍：?????? VitaNavi Tech公司的核心产品是一类经基因工程改造的Taq DNA聚合酶，主要有Klentaq、Omni Taq、Omni Klentaq、Cesium Taq或Cesium Klentaq等，每一种聚合酶包括常规和LA（long accurate）两种类型。Klentaq是缺失了N端278个氨基酸的Taq酶，与野生型Taq酶相比，截短的Klentaq酶具有更高的保真性和热稳定性；Omni 酶是从文库中筛选出来的具有极高耐受性的Taq或者Klentaq突变体，可以直接以全血、血清、土壤、牛奶、巧克力或奶酪等材料为模板一步扩增目的基因，避免了繁琐的核酸DNA提取过程；Cesium酶是筛选出来的另一种聚合酶突变体，其特征是在常温下活性很低，而当温度达到68℃以上时，Taq酶的活性得到完全恢复，因此，Cesium酶具有天然的热启动（Hot start）特性。VitaNavi Technology产品选购?

苏州蚂蚁淘生物科技有限公司是一家依托于中科院生命科学领域的高新技术生物公司，致力于生命科学领域产品的研发与销售，蚂蚁淘生物秉承为客户提供高质量产品及优质服务的理念，从事科研机构及生产企业所需的各种品牌生化剂、抗体、血清、ELISA试剂盒、移液枪、中小型仪器设备、耗材等专业进出口公司。主要经营品牌abcam、abnova、peprotech、RD、CST、AbD Serotec、Athens Research Technology、Chemicon 、Evrogen、 Bio-Rad、 Zymed、wako、bachem、Exiqon、Invitrogen、Eppendorf、Bioassay、cayman、TRC、Omega、Promega、Axygen、AssayPro等品牌中国区域.代理商,自成立以来发展迅速，产品服务得到全国广大生产企业、高校、科研院所、医疗系统及相关试剂公司的肯定，我们愿竭尽所能，赛因百奥生物在保证产品质量的基础上将以超低价格为您提供优质服务；同时也为广大经销公司提供充足货源，我们的目标是努力成为国内生物学产品行业专业供应商。