经验总结：

1.多聚赖氨酸：我用的浓度是25mg/ml,重复了4次时，不影响细胞贴壁。2.接种液：DMEM高塘+20％FBS+1％P/S3.消化：0.125％胰酶10min或者0.08％胰酶15min没有区别。4.消化终止后，1ml*头吹打，滤网过滤不影响细胞状态，但吹打过多好像细胞状态变差。5.接种密度：似乎没有太多限制。我觉得我用3～5×10 5/CM2好像细胞状态不错。6.生长培养基：DMEM/F12+2％B27+1mM Gln7.换液时间：第一次换液在接种后12小时左右左右。以后每隔2天换液。觉得早期应该及时换液，特别是DIV4或7时，以后每那么严格，推迟1～2天似乎关系不大。不过2周以后细胞代谢挺强的，培养基容易变黄，所以一般根换2/3的培养基。

细胞培养参考文献：Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death.（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11920724）

具体培养步骤：

大鼠大脑皮层神经元原代培养

1)主要溶液的配置及保存

(1)终止液及接种培养基：在DMEM高糖培养基中加入20%FBS，1mM L-谷氨酰胺，10mMHEPES，8mM葡萄糖，1mM丙酮酸钠，100mg/L青链霉素双抗；4℃保存，1周内用完。

(2)生长培养基：在DMEM/F12培养基中加入2%B27-OA，1mM L-谷氨酰胺，30mg/L青链霉素双抗；现配现用。B27-OA 在无菌环境下分装后-20℃避光保存。

2)细胞培养瓶及盖玻片的预处理

无菌去离子水稀释L-多聚赖氨酸至工作浓度 25mg/mL，包被25cm2培养瓶或24孔板内小盖玻片（8×8mm2），37℃，5%CO2培养箱静置24小时，回收多余的多聚赖氨酸，无菌去离子水清洗培养瓶及培养板表面，每次5分钟，重复3次，培养箱中放置4小时以上备用。

3)原代神经元培养

取新生 24h 内 SD **鼠，75%乙醇浸泡消毒。断头处死后剪开皮肤和颅骨，暴露两侧大脑半球，用镊子取出双侧大脑皮层并放入预冷的含有DMEM高糖培养基的培养皿中，培养皿置于冰床上，去除残留血管和脑膜。用眼科剪将脑组织剪成约1×1×1mm3的小块，0.125%胰酶，37℃环境消化10分钟，并用含血清的终止液终止消化；用1mL*头轻柔吹打至细胞悬液。经 200 目滤网过滤。收集过滤后的细胞，800rpm离心5分钟，弃上清，接种培养基重悬细胞。血球细胞计数器计数。以2~3×105/cm2的接种密度接种于包被好的25cm2培养瓶中或细胞爬片上，37℃，5%CO2培养箱中静置培养。约12~16小时后，弃除接种培养基，以预热的DMEM/F12培养基轻柔漂洗细胞1次，将培养基全量更换为生长培养基继续培养。以后每隔2天半量换液，2周后每隔2天更换⅔液体。倒置显微镜下观察神经元生长情况。

细胞免疫荧光

1)选择皮层神经元，弃培养基，PBS预热至室温，轻柔漂洗，每次5分钟，重复3次。

2)固定：4%多聚甲醛室温固定10分钟，PBS漂洗，每次5分钟，重复3次。

3)通透：0.3%Tritonx-100透膜10分钟，PBS 漂洗，每次5分钟，重复3次。

4)封闭：5% BSA/PBS常温孵育 30分钟封闭非特异性结合位点。

5)一抗孵育：弃BSA/PBS，加入稀释的兔抗大鼠MAP2抗体(1：100)，4℃过夜。

6)复温：室温孵育1小时，弃一抗，PBS 漂洗，每次5分钟，重复3次。

7)二抗孵育：加入山羊抗兔IgG-CY3抗体（1：100），室温避光孵育30分钟，弃二抗，PBS 漂洗，每次5分钟，重复3次。

8)复染：对DIV30组，加入DAPI(5μg/mL) 复染细胞核，室温避光孵育5分钟，PBS 漂洗，每次5分钟，重复3次。

9)甘油封片。

荧光显微镜下观察MAP2及DIV30组MAP2、DAPI染色情况。

蛋白提取及定量：

提取全细胞蛋白。

弃培养基，预冷的PBS漂洗细胞2次，吸尽PBS。在培养瓶中加入400μL预冷的PBS，细胞刮刮取细胞，移入预冷的EP管中，重复上述过程3次。将获得的细胞悬液600×g离心5分钟，弃上清，沉淀600×g离心1分钟，弃上清，重复上述过程1次。按照RIPA裂解液步骤操作。提取蛋白前在蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂及PMSF。于冰上按照每20μL细胞沉淀中加入100μL裂解液，最高速剧烈Vortex 5秒，使细胞沉淀完全悬浮并分散开。冰上裂解10分钟，每隔3~4分钟Vortex 5秒。4℃，15,000rpm离心10分钟。将上清液移入新的预冷的EP管中。将所得蛋白采用NanoDrop微量紫外分光光度计粗测蛋白浓度。剩余的蛋白-70℃保存。

细胞浆蛋白及细胞核蛋白的提取：

弃培养基，预冷的PBS漂洗细胞2次，吸尽PBS。在培养瓶中加入400μL预冷的PBS，细胞刮刮取细胞，移入预冷的EP管中，重复上述过程3次。将获得的细胞悬液600×g离心5分钟，弃上清，沉淀600×g离心1分钟，弃上清，重复上述过程1次。按照细胞核细胞浆抽提试剂盒步骤操作。提取蛋白前在蛋白裂解液中加入PMSF。按照每20μL细胞沉淀中加入100μL细胞浆蛋白抽提试剂A。最高速剧烈Vortex5秒，使细胞沉淀完全悬浮并分散开。冰浴10~15分钟。加入细胞浆蛋白抽提试剂B 4μL。最高速剧烈Vortex5秒，冰浴1分钟。 最高速剧烈Vortex5秒，4℃ 15,000rpm离心5分钟。立即吸取上清至一预冷的EP管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入25微升细胞核蛋白抽提试剂。最高速剧烈Vortex15~30秒，使细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1~2分钟再高速剧烈Vortex15~30秒，共30分钟。4℃ 15,000rpm离心10分钟。 立即吸取上清至一预冷的EP管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。

神经元图片

倒置显微镜下大脑皮层神经元形态形态。标尺=20μm（20×），10μm（40×）。

a：DIV1 （20×）；b：DIV1 （40×）；c：DIV4（ 20×）；d：DIV10（ 20×）。

荧光显微镜下大脑皮层神经元形态。标尺=50μm（10X），25μm（20X）。

a：DIV7( 10×)；b：DIV7(20×)；c：DIV20(10×)；d：DIV20(20×)；e：DIV30(10×)；f：DIV30(20×)；g：DIV30 细胞核形态（20×）；h：f与g的合成图像（20×）。