0 收藏 0 阅读

试剂

CaCl2 2mol/L

溶解 29. 41 g 的 CaCl2 • 2 H20 到 100 ml H2O, 无菌过滤。

细胞

293T (ATCC： CRL-11268)

HT1080 (ATCC： CRL-121)

DMEM 含 4. 5 g/L 葡萄糖、 3. 7 g/L NaHCO3、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 100 mg/L 庆大霉素

乙 醇（100%)

胎 牛 血 清（FBS)

2X HBS

在 180 ml H2 〇 中溶解 2. 38 g HEPES、 3. 28 g NaCl、 42. 4 mg Na2 HPO4 ，调 pH 至7.12, 加 水 到 200 ml, 无菌过滤。

乳 糖 溶 液（4 % )

在 IOOml PBS 中溶解 4 g a -乳 糖 一 水 化 物（SigmaAldrich) , 无菌过滤。

P E G 8000 ( 4 0 % ；Sigma-A ldrich )

100 ml PBS 中溶解 4OgPEG, 室温搅拌过夜，然后高压灭菌， 4°C 保 存 。

磷 释 盐 缓 冲 溶 液（PBS)

在 800 ml H2O 中溶解 8 g NaCl 0.2 g KC1、 L 44 g Na2 HPO4、 0. 24 g KH2PO4, 调 pH 至7 . 4 , 补 H2O 至 1L, 高压灭菌。

质 粒

包 装 质 粒 ： pCM V -G P

V SV -G 表 达 质 粒 ： PCMV -G

聚 凝 胺（4m g /m l 溶 于 P B S ; Sigma-A ldrich )

含 G F P 基 因 或 药 物 筛 选 标 记 的 反 转 录 病 毒 载 体
T E 79/10

lm m o l/L T ris (p H 7. 9)

0.lm m o l/L E D T A

无菌过滤。

仪器

A c ro d isc 注 射 器 滤 器

用 0.45um 低蛋白质结合力的滤器（ Pall Gelman laboratory, AimArbor, Michigan)。

离 心 机（ B eckm an A llegra 6 tab leto p ) P T S -2000 转 头

培 养 皿（100m m )

E ppendorf therm om ixer R m ixer (E p p en d o rf， W e stb u ry , N ew Y ork )

流 式 细 胞 仪（F A C S )

注 射 器（IOml)

D N A 转 染 用 管（12m m X 75m m 聚 苯 乙 烯）

离 心 管（超 速 离 心 ， 25m m X 89m m ; U ltra -C le a r， B eckm an C oulter)

超 速 离 心 机（B eck m an C o u lter) SW 2 8 转 头

方法

载体产生

1 . 在 1 0 0mm 培 养 皿 上 接 种 2 x 1 0 6 个 2 9 3 T 细 胞 ， 完 全 DMEM/1 0 % FBS , 培 养 细 胞过夜。

293T 细胞传代时间大约 20 h , 这种细胞系在 2 个月内能保持很高的转染效率。然 而 ，细胞生 长 超 过 3 个月会突然丧失产生载体的能力。因此不要培养细胞趄过 3 个月。

2• 用 IO m l 新 鲜 培 养 基 更 换 旧 的 培 养 基 ，继 续 在 CO2 孵 育 箱 中 培 养 细 胞 1〜 2 h

293T 细胞增殖很快。在转染当天更换培养基以确保培养基有最优的 p H 以有效转染。转染时细胞密度应达到 7 0 % 汇合度。低的细胞密度会减少载体滴度。有人在 8 0 % 汇合度的细胞密度时转染，能产生高滴度的载体。更高的细胞密度不仅能增加载体的产量，而且也能延长载体收集的时段，因为细胞在高密度时能更好地抗 VSV-G 诱导的细胞分离。

3.按如下准备新鲜的转染溶液：
a. 在 12 mmX 75xnm 聚苯乙烯管中混合 15ug 的 p P Y -1、 15M g 的 p C M V -G P 、 2ug的 p C M V -G 。

b. 加 TE79/10 溶液至总体积 437m1。

c. 力 [I 63pl 2mol/L CaCl2，混句。

d.逐滴加 500M 12XHBS 溶液，并不停搅拌。

e•室温孵育 30 min，以便磷酸钙和 DNA 形成沉淀。

30 min 孵育后磷酸钙沉淀应形成，溶液变混浊。如未观察到，用新鲜的转染溶液重复沉淀步骤。 2 X H B S 溶液的 p H 是转染成功的最关键因素。如溶液的 p H 在储存过程中发生变化，则应换用新的溶液。

V S V - G 对哺乳动物细胞有毒性，增 加 p C M V - G 转染的量会导致载体滴度的降低。这会导致转染的 2 9 3 T 细胞因为 V S V - G 的过表达而在成熟前死亡。因此，在载体产生中应保持p C M V - G 的量最低。

4 . 将 DNA 沉淀加人步骤 1、 2 准备的 293T 细胞中混匀，在培养皿上再孵育 5〜6 h，用6m l 新鲜的培养基代替并孵育过夜。用 6 ml 培 养 基（而不是 IOml) , 是为了减少收集的载体体积以便接下来的载体纯化和浓缩步骤。

5.在 DNA 转 染 24、 40、 48、 64 和 72 h 后从同一个培养皿中收集含载体的培养基。每次收集时，用 6 ml 新鲜培养基替换，以便下次的载体收集。
新鲜培养基应小心地沿着培养皿的边缘加，因为转染和 VSV-G 表达的毒性会导致细胞容易脱落。

VSV-G 过表达诱导的细胞毒性会变得越来越明显。转染后 7 2 h , 大多数细胞会从培养皿上脱落。假如在该时间点上没有观察到细胞毒性如台孢体形成或细胞脱落，转染可能已经失败了，可以预计载体滴度会很低。

6•将培养基在 PTS——2000 转头， Beckman Allegra 6 tabletop 离心机中室温 2500r/min离 心 5 min。收集上清，用 0 . 4 5 um 的注射器过滤。载体立即一 80°C 保存直到纯化步骤。

载体纯化

7.溶解粗提的载体制备物，与 4 0 % 的 PEG 储液混合，使 PEG 终浓度达 1 0 % 。

8.将 PEG载体混合物置于冰上 4 h，或冰箱放过夜。

在 P E G 中的载体非常稳定：在 4°C 可保存 1 周 ，感染滴度丢失很少。
收集的载体能直接超速离心而不用 P E G 纯化。但是，得到的载体比 P E G 纯化后的载体在不同的细胞类型中更容易引起细胞毒性。因此极力推荐 P E G 步骤。

9•将载体在 PTS^2000 转 头， Beckman Allegra 6 tabletop 离心机中 3000r/min 离心 3Omin0

10.用 含 4 % 乳糖的 P B S 或 10% F B S 的 D M E M 重悬载体。用 1/10 或 1/30 的原始体积收集重悬载体。

部分纯化后的载体可直接用于转导或继续超速离心得到更高滴度的载体制备。在重悬溶液中加乳糖或 FB S 能在保存时稳定 M LV 载体。含重悬载体的溶液通常是混浊的，因为里面有残余的 PEG。增加重悬液的体积能减少混浊度。但是，残余的 PEG 不会影响细胞转导。保存中残余的 PEG 似乎能稳定载体。延长一 80°C 保存的时间基本不会使载体丢失感染性 ，而与未进行 PEG 处理的载体相比，多次冻融对载体滴度影响要小得多。通 过 将 p e g纯化前后的载体制备物进行凝胶电泳和银染发现 PEG 沉淀去掉了大量污染的细胞蛋白质 。从条带浓度上看，超 过 95% 的 FBS 通过该步骤被除去。在滴度方面，该步骤的栽体回收率 很 髙（8 0 % 〜1 0 0 % ) 。

载体浓缩

1 1 . 用 1 0 0 % 乙 醇 将 U ltra-C le a r 超 速 离 心 管（25m m X 89 mm) 、适 配 器 、 SW 2 8 转 头 的螺 帽 消 毒 ，在 层 流 罩 中 空 气 干 燥 。

12•将 P E G 纯化的载体制备物转移到无菌的超速离心管中，加 P B S 或 D M E M 到 37 ml。

13• 将 载 体 在 S W 2 8 转 头 ， B e c k m a n C o u l t e r 超 速 离 心 机 中 4°C , 25 O O O r / m i n 离心 90m i n

14.弃上清，在层流罩中反转离心管几分钟以除去液体。加〇.5〜 I m l 4 % 乳糖或D M E M 重悬载体。

15.4°C ，在 Eppendorf thermomixer R mixer 中以 800r/m i n ，将载体在乳糖溶液或D M E M 中振荡 3〜4 h 。

重悬的载体溶液是混浊的，因为有残余的 PEG。如载体在 DMEM 中重悬，补 加10%FBS,载体制备物存储在一 3 〇° C 。

滴度确定

16.H T1080 以 2X106 个接种在 100 mm 培养皿上，加完全培养基 D M E M /l 〇%F B S 。另外准备一个培养皿第二天进行细胞计数。细胞培养过夜。

17.—个培养皿消化并计数，另一个培养皿用含 A fjtgA n l 的聚凝胺的新鲜培养基替换旧培养基。用 D M E M 稀释浓缩的载体，加 到 H T 1080±§养皿中，孵育过夜。

18.用新鲜的无聚凝胺的培养基替换，继续孵育过夜。

19•消化细胞，离心，用 l m l D M E M /10% F B S 重悬，进行流式分析。

20.计算载体滴度 （感染性的颗粒/m l ):
转导当天的总细胞数 X F A C S 确定的 G F P + 细胞百分比 X 载体稀释因子
如果滴度确定中用了药物选择性标记，每 I O O m m 培养皿中 2 X IO5 个 H T 1 0 8 0 细胞，因为当细胞活跃增殖时选择性最有效。如果细胞在培养皿中汇合，需要其他选择来消除非转导的背景: