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扩增已知序列旁邻的未知DNA序列的高效TAIL-PCR方法(hiTAIL-PCR)_山里...
2024-05-04
扩增已知序列旁邻的未知DNA序列的高效TAIL-PCR方法（hiTAIL-PCR） (2008-04-12 14:08:22)转载▼ 扩增已知序列旁邻的未知DNA序列的高效TAIL-PCR方法High-efficient thermal asymmetric interlaced PCR（hiTAIL-PCR）Want to mining unknown sequencesquickly?Just hi-TAIL it!引子:扩增已知序列旁邻的未知DNA序列是分子生物学研究中非常重要的任务。华南农业大学的Yao-Guang教授发明的TAIL-PCR是解决该问题的有效方法。为了提高获得特异的、长片段目标产物的成功率，最近刘教授对TAIL-PCR方法作了较大改进，创建了新的hiTAIL-PCR方法（LiuChen，2007）。该方法用在水稻、拟南芥、番木瓜、昆虫等生物的未知DNA序列扩增都获得很好效果。本文所介绍LAD简并引物及AC1引物都是通用的，而特异引物序列是基于CAMBIA载体1302、1305、1300的RB边界附近序列设计的，用于扩增上述载体的转基因植株的T-DNA插入点旁邻未知基因组序列非常有效。使用者也可根据本文的原理，利用本文的LAD简并引物及AC1引物，再加上自行设计的特异引物，扩增其他类型的未知DNA序列。参考文献：High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknownflanking sequences. Yao-Guang Liu andYuanling Chen. BioTechniquesVol. 43, No. 5:pp 649-656(Nov2007)AbstractIsolation of unknown DNA sequences flanked by known sequences is animportant task in molecular biology research. Thermal asymmetricinterlaced PCR (TAIL-PCR) is an effective method for this purpose.However, the success rate of the original TAIL-PCR needs to beincreased, and it is more desirable to obtain target products withlarger sizes. Here we present a substantially improved TAIL-PCRprocedure with special primer design and optimized thermalconditions. This high-efficiency TAIL-PCR (hiTAIL-PCR) combines theadvantages of the TAIL-cycling and suppression-PCR, thus it canblock the amplification of nontarget products and suppress smalltarget ones, but allow efficient amplification of large targetsequences. Using this method, we isolated genomic flankingsequences of T-DNA insertions from transgenic rice lines. In ourtests, the success rates of the reactions were higher than 90%, andin most cases the obtained major products had sizes of 1–3kb.该杂志是免费登陆浏览的：http://www.biotechniques.com下面介绍一下该方法的原理及设计引物和实验过程应该注意的事项，供参考。如在使用该方法过程中有信息或问题需反馈，可直接留言，以便改进。1.TAIL-PCR1.1原理利用简并引物在靶序列上创造结合位点B 利用nestedPCR提高扩增产物特异性利用2轮高温、1轮低温交替的超级PCR循环提高特异产物的扩增，降低非特异产物的比例模板高倍数稀释以降低非特异产物在下一轮作模板的比例通过电泳检测第2轮和第3轮产物相差的大小来判断产物的特异性图1: 第一轮扩增图2:第二轮扩增图3:第三轮扩增1.2TAIL-PCR 待改进之处AD引物的结合位点有限，因而成功的几率不够高特异产物大小难以控制，常扩增到 500bp产物在第2及第3轮中仍可检测到非特异带，而理想的状况是要么出现特异带，要么没有任何带2.hiTAIL-PCR2.1 结合利用TAIL-PCR和抑制PCR的原理利用5’带尾巴的高简并倍数的LAD引物在靶序列上创造结合位点，并抑制两端均为LAD引物的非特异产物的扩增利用5’带尾巴的第1轮特异引物抑制短的特异产物的扩增C 利用nestedPCR提高扩增产物特异性利用2轮高温、1轮低温交替的超级PCR循环提高特异产物的扩增效率，降低非特异产物的比例利用高稀释倍数降低非特异产物在下一轮作模板的比例F 抑制PCR的原理：当PCR产物两端有反向重复序列时，可配对形成茎环结构。茎的形成会影响其与引物的结合，从而降低扩增效率。茎的长度越长、环的长度越小抑制作用就越强。2.2 hiTAIL-PCR的引物设计RB-0a，RB-1a，RB-2a：For pCAMBIA1305 or 1302RB-0b，RB-1b，RB-2b：For pCAMBIA1300通用扩增引物：AC1，16nt，Tm＝52℃特异nested引物：预扩增：Tm 60℃的特异序列第1轮： 18nt 与LAD5’相同的尾巴＋Tm 68℃的特异序列第2轮： Tm 68℃的特异序列A long(33-34 nucleotides) arbitrary degenerate (LAD) primer with a higherdegree (2304 or 6912 folds) of degeneracy is used to createprimer-binding sites efficiently along the unknown targetsequences. An additional sequence (18 nucleotides with Tm=58 °C)identical to the 5’ part of the LAD primer is tagged to the 5’end of a long primer (Tm 68 °C ) specific to the knownsequence. This specific primer and a shorter primer (16 nucleotideswith Tm=52 °C ) for the created LAD sites are used for the primaryTAIL-PCR. This design combines the advantages of the TAIL-cyclingand suppression PCR, thus can suppresses the amplification of bothnon-target products and target ones of small sizes (less than about300 bp), while allows efficient amplification of large targetsequences.2.3hiTAIL-PCR 的试剂准备模板 DNA：常规方法提取。用5 mMTris-HCl pH8.0 或 1/3 x TE 稀释成 20-50ng/μL.（电泳检测调整浓度）引物：溶解于 5 mM Tris-HClpH8.0。工作浓度：LAD 20 μM ， 其它引物 6.0 μM（配制新合成的引物最好重新测定浓度）Ex-Taq DNA polymerase： Takara, or otherhigh-performance Taqpolymerases10x Ex-Taq buffer：containing 20 mM MgCl2 or corresponding PCR buffers of otherTaq polymerasesdNTPs mixture ：2.5 mM each of dATP, dCTP, dGTPand dTTP.Mini-Q ddH2O2.4hiTAIL-PCR 的扩增体系预扩增 Pre-amplification引物：LAD＋RB0 终浓度: LAD =1.0μM ，RB0=0.3μM 模板：20-50 ng基因组DNA / 20 μLreactionTaq酶：0.5U / 20 μLreactionPrimaryreaction引物：AC1＋RB1 终浓度:Ac1 =0.3 μM ，RB1=0.3μM模板：预扩增产物－50×，取1 μL / 25 μLreactionTaq酶：0.625U / 25μL reactionSecondaryreaction引物：AC1＋RB2 终浓度:Ac1 =0.3 μM ，RB2=0.3μM模板：第一轮扩增产物－10×，取1μL / 25 μL reactionTaq酶：0.5U / 25μL reaction2.5hiTAIL-PCR 程序（MJ机）2.6 hiTAIL-PCR 注意事项特异引物的Tm预扩增引物： Tm 60℃第一轮及第二轮引物： Tm 68℃第一轮特异引物的尾巴序列不能与AC1完全相同，应该在3’末端比AC1多数个碱基以减少两端都是LAD引物的非特异产物在下一轮的扩增机会预扩增前10个循环高温循环是单线性扩增，目的是增加特异模板的比例25℃退火只能1个循环 ，避免产生过多的非特异产物电泳检测琼脂糖胶浓度1％较好，过高浓度会导致大分子产物分不开
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