离体神经突触的代谢性标记实验
| 固定剂温育液氯霉素放射自显影乳剂显影剂SDS样本缓冲液 |
一、放射自显影神经元在条件培养基中培养 2d，如第十章所述。 1.用一个锋利的微电极从胞体分离神经突起，并用牵引电极将胞体移出培养皿 (见第十章)。 2.在培养液中加入终浓度 0.lmmol/L 氯霉素，阻断线粒体蛋白的合成。 3.小心移去培养液并用温育液洗涤 6 次，每次 Imin。保证轴突始终被一小部分液体覆盖；一旦干了，轴突便会崩解。 4.在含 0.5mCi/ml 反式-35S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的温育液内标记 30 min。 5.用含 lmol/L 未标记半胱氨酸和蛋氨酸以及 0.1_d/L 氯霉素的温育培养液洗漆 6 次，每次 40 min。 6.用 1% 的多聚甲醒和 1% 的乙酸固定 2 h。 7.用一系列浓度递增乙醇脱水。 8.于空气中干燥。 9.浸入放射自显影乳剂。 10.曝光 2~7 山具体时间根据 35S 标记掺入蛋白的速度而定。 11.D19 中显影。 12.水中短暂漂洗。 13.20%Na2S2O3(硫代硫酸钠）水溶液固定。 14.水洗漆 20 min。 15.封片液或甘油封片。 二、聚丙烯酰胺凝肢电泳1.从胞体分离神经突起并去胞体。 2.0.1 mmol/L 氣霉素预温育分离的神经突起 30 min。 3.用温育液洗漆 6 次，每次 Imin。 4.在含 0.5mCi/ml 反式-35S 和 0.1 mmol/L 氯霉素的温育液内标记 2.5 h。 5.温液洗涤 6 次，每次 30 min。 6.20ul SDS 样本缓冲液收集神经突起，并转移入微量离心管。 7.煮沸 5 min。 8.样本于 12OOOr/min, 离心 2 min。 9.取上清液加样到 8% SDS-PAGE 进行电泳。 10.50% 甲醇和 10% 乙酸固定凝胶 30 min。 11.用扩增仪处理凝胶 20 min。 12.千燥凝胶。 13.在 X 射线胶片（KodakBiomaxMS) 上曝光 1~3 周。 14.显影胶片 三、结果为了解神经突起内蛋白的合成部位以及这些部位合成蛋白的异质性，我们应用反式-35St 示记技术通过 35S 标记的半胱氨酸和蛋氨酸标记了离体神经突起。如果离体轴突确实存在蛋白合成，那么这些放射标记的氨基酸将能够掺入蛋白，并被放射自显影方法检测到。结果证明神经突起能够合成各种各样的蛋白，而且这个过程主要发生在曲张体和生长锥（图 3-6)。 |
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