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CNS 移植物对供者年龄有一定要求，只有来自胚胎/胎儿或新生供者的移植物才能在分离后直接移植成功。一般认为，移植的最佳时期是在神经元进行最后的细胞分裂而没有形成广泛的轴突投射之前（Bj6rklundandStenevi1984)。..

1.最好选择知道确切交配时间（阴栓阳性的日期）的孕鼠。在交配成功之后的第一个清晨，检查雌鼠，可在阴道处发现黄白色阴栓，将这一天定义为胚胎 0 天 (embryonicday0，E0) 〇胎龄还可以通过其与顶臀长 (crown-to-rumplength,CRL; 表 14-1) 的关系推知，把胚胎放在载玻片上以毫米为单位测量顶臀长。通过练习，可以通过触诊孕鼠（用乙醚轻微麻醉）测量胚胎的大致年龄。对于大鼠来讲，E13 前后的胚胎呈清楚的球状，其直径与顶臀长相近（DunnettandBj6rklund1992)。E18 以后的大鼠胚胎被称为胎鼠.

2.胚胎组织的最适年龄视具体实验要求而定。下面介绍了不同脑区适宜移植的胎龄。不同品系的啮齿类动物的孕期会有所差异，但大鼠一般为 21~22d, 小鼠一般为 19~20d。除非特别指明，本章给出的实验方法主要是针对大鼠的。读者如果想了解小鼠大脑中相应脑区适宜移植的发育时期，请査阅相关的文献 S:Alvarez-Bolado 和 Swanson(1996) 总结出了一条规律：在妊娠第一周，大鼠的发育比小鼠晚 1-1.5d, 在第二周晚 2d, 在第三周晚 3-4d。

1.经过深度麻醉，供者腹部去毛并以 70% 乙醇消毒，用消过毒的器械开腹，用另一套消过毒的剪刀和慑子取出子宫角，放在盛有培养基的消毒小管中。之后，处死供者 (过量给药或断头)。用小剪刀和小镊子把胚胎从子宫角中一个一个地分离出来，放进盛有培养基的已消毒带盖培养皿（petridish) 中。

2.胚胎可以在肉眼下，用显微剪或锋利的解剖刀片从近尾段断头（除非需要分禽脊髓的某一特殊部位)。这样，脑与上段脊髓分离出来。将头移入一个新的培养皿并置于解剖显微镜下，用两把眼科镊撕去脑外包绕的其他组织，如皮肤、肌肉、头骨脑膜。在剥离过程中，注意不要伤及脑组织。可以在头骨上做一正中切口，以便于剥去发育中的软骨。

3.将脑组织移入盛有新鲜培养基的培养皿以备进一步做特定脑区的分离。在这一步操作中，应多次用培养基冲洗脑块，以去掉残血和组织碎片。

以下介绍了一些最常用脑区的分离方式，图 14-2 为这些脑区在发育中啮齿类动物脑内的定位。

如果希望进一步了解情况，读者可以查阅啮齿类动物 CNS 发育相关的详细图谱和文献（AltmanandBayer1995;BayerandAltman1995;Alvarez-BoladoandSwanson1996)。下面的实验方法由本章作者选自相关文献。由于各个脑区发育特征不同，在具体实验过程中应对移植物分离的具体细节做出相应调整，以求完善实验过程。选择不同的发育时间点，在分离所得移植物中会有不同的细胞类型及不同的前体细胞、成熟细胞和分化细胞比例。不同脑区分离方法可参考 Seiger(1985) 和 Dunnett 等（1992,1997) 的文章。

对于任何分离手术来讲，均须注意下列事项：

1.脑组织必须用镊子小心轻取，镊子捏取的部位应尽量远离目的脑区，不要直接捏挤目的脑区本身，目的脑区要用锋利的显微解剖剪剪下。

2.在向小管或小皿中转移小块移植物时，不能直接用镊子夹起，应用剪刀或弯头镊子从下方托起，以保证组织块处于适中的表面张力下。

3.在分离过程中，组织块在分离用培养基中可置于室温下保存。

神经节隆起（ganglioniceminence) 位于前脑脑泡（telencephalicvesicle) 底部（图 14-3)，发育形成纹状体（corpusstriatum), 包括纹状体（striatum) 或尾状核（caudateputamen) 和苍白球（pallidum)(SmartandSturrock1979)。大鼠尾状核神经发生始于 E12，终止于出生后第 3 天，在 E15 达到高峰（Bayer1984;MarchandandLajoie1986)。外侧神经节突起（lateralganglioniceminence,LGE) 和内侧神经节突起（medialganglioniceminences,MGE) 在移植实验中已被广泛应用，尤其是在亨廷顿病的动物模型实验中（Wictorin1992;Bj6rklundetal.1994)。近来，研究者开始注意这两个隆起与纹状体和其他相关脑区的不同关系。实验表明，LGE 是形成纹状体神经元的主要区域，可以形成投射神经元和一部分共表达 GABA 和生长素抑制因子（somatostatin) 的纹状体中间神经元（Olssonetal.1998b)。MGE 主要形成苍白球和前脑基底部的神经元以及纹状体的胆碱能中间神经元（Olssonetal.1998b)。由于这些研究成果的出现，针对神经节隆起有了多种不同的分离方法。根据不同实验所需的区域或细胞种类，可选择 LGE 单独分离或 LGE 和 MGE 同时分离。具体的分离方法同样受胎龄影响，在大鼠最常用的是 E12\'15, 在小鼠常用 Ell~14。关于分离神经节隆起的详细情况可在 Olsson 等（1995) 的文章中査到。下面的实验方法可以用于同时分离 LGE 和 MGE 或单独分离其中的一种结构（图 14-3 为 E14~15 大鼠 LGE 和 MGE 同时分离的示意图)。

1.大脑腹面向下放置，沿端脑泡皮质的中脊纵向切开，皮质层向两侧打开以暴露下面的神经节隆起。

2.欲同时获取 LGE 和 MGE, 可依图 14-3 所示，从尾状核角部切下一块心形组织。如果只取 LGE 或 MGE, 先在两个隆起间做一切口，然后水平分离获取所需部位。如水平切口较浅，则主要获得生发细胞；如果切口较深，也可获得分化细胞。

在大鼠胚胎隔区和斜带核（diagonalbandnuclei) 的发育过程中，胆减能细胞产生于 E12-16(SembaandFibiger1988), 这些区域已经用于痴呆或衰老模型的移植治疗。有报道说，使用 EW-15 分离的胚胎隔区可获得较高的存活率和较好的治疗效果 (Nilssonetal.1988)。如图 14-4 所示，隔区可以用两种方法分离，即常规方法可以同时获得隔区和对角带（diagonalband) 的可变区；用特异的方法分离只得到隔区（Dunnettetal.1986;Nilssonetal.1988;Dunnett and Bjorklund1992)。

1.常规方法（图 14-4A~C): 大脑背面向下放置，由腹侧面做两个冠状切口，一个在未发育的嗅球后（图 14-4B-1), 另一个在下丘脑嘴侧（图 14-4B-3)。之后，在神经节隆起或纹状隆起（striataleminence) 内侧做双侧矢状切口（图 14-4B 和图 14-4C-2), 最后，由背侧分开隔区和皮质原基（corticalanlage)(图 14-405)。

2.特异方法（图 14-4D~F): 在前脑于嗅球和下丘脑之间做冠状切片，图 14-4D 为侧面观，E 为腹侧面观，之后，可以从冠状切片腹内侧部分离出隔区，在去掉覆盖着的纹状隆起之后，可以由切片腹外侧部获得发育中的基底核（nucleusbasalisofmeynert,NBM)。

实验者常由胚胎的腹侧中脑（ventralmesencephalon,VM) 分离获取发育中的多巴胺目神经兀，用于帕金森病动物模型的治疗（Brundinetal.1994)。在大鼠，腹侧中脑的多巴胺能神经兀产生于 E13~15(BayerandAltman1995), 这一阶段的供体组织较利于移植。腹侧中脑的分离方法如图 14-5 所示，进一步的细节与参考资料见 Dunnett 等（1997) 的文章。

1.胚胎腹侧面向上放置，分别在中脑与间脑交界处和中脑曲尾部做冠状切口，可以分离得到双侧腹侧中脑。具体操作方法如下：先在中脑曲嘴侧做冠状切口（图 14_5A-1)，之后在中脑尾侧做冠状切口（图 M-5A-2)。冠状切口的位置也可以依照覆盖其上的丘胎 I(thalamus) 及顶盖（tectum) 表面的标志来定位，如图 14-5D 辅助线所示。最后，如图 14-5C 所示，在图 14-5A-3 和图 14-5B-4 处做两个矢状切口，获得组织块。

2.在去掉脑膜时应特别小心，可先完成解剖分离，然后在解剖显微镜下通过提起间叶细胞层去掉脑膜。
CNS 移植物对供者年龄有一定要求，只有来自胚胎/胎儿或新生供者的移植物才能在分离后直接移植成功。一般认为，移植的最佳时期是在神经元进行最后的细胞分裂而没有形成广泛的轴突投射之前（Bj6rklundandStenevi1984)。..

在局部缺血等疾病模型中，海马（hippocampus) 组织有广泛的移植应用（T6nderetal.1989;Hodgesetal.1994)。在胚胎发育过程中，海马神经元形成相对较晚，在出生后齿状回仍能产生很多颗粒细胞（BayerandAltman1995)。最近发现，成年啮齿类动物齿状会终生保持形成神经元的能力（Gageetal.1998)。为了获取含有丰富锥形神经兀的移植物，可以选择 E18 的大鼠或出生后仍处于发育期的动物（SundeandZimmer1983)。在后一时间点分离可以获得海马结构中某一特定区域的细胞。图 14-6 为 E18 大鼠胚胎海马原基的解剖图。

为了到达海马层，由皮质原基中线旁开一贯穿全长的辅助纵向切口（图 14-6A)，在尾端，这一切口恰好沿着海马原基的侧面。向两侧拉开发育中的皮质（图 14-6B)，切断扣带回（cingulatecortex) 和海马伞（fimbria), 轻轻向后推海马组织，使之与下面的丘脑脱离（图 14-6C), 最后，切断海马下端的连接，去掉脑膜和新皮质（图 14-6D)。

将皮质原基完整地沿纵向剥下，即获得完整的烦顶部新皮质（neocortex)。新皮质常用于新生鼠或成年鼠皮质梗死等疾病模型的移植实验，参见 Castro 等（1988)、Grabowski 等（1992) 和 Kdb 等（1994) 的文章。新皮质发育相对较晚，据报道，较好的移植时机为妊娠中期或出生后数天内。

1.首先，沿端脑泡中线纵向切开整个新皮质，向两侧打开新皮质。在嘴侧和尾侧各做一冠状切口，并沿着神经节隆起纵向切开，就获得了整块组织。可以再按照具体某个脑区的要求确定组织块的大小和保留脑区。

2.在取组织块之前或之后撕下脑膜均可。

发育中 CNS 的其他区域也可以作为移植实验的供体组织，例如，脊髓（Bregman1994), 小脑原基（SoteloandAlvaradoMallart1987)，视网膜（LundetaL1987)，下丘脑（WoodandCharlton1994)，蓝斑（Bjtirklundetal.1986) 和背侧中缝核（Fosteretal.1988)。具体分离方法见 Seiger(1984) 和 Dunnett 等（1992) 的文章。

分离出来的移植物需要进一步制备，制备的方法有如下三种：分离后含有残存的组织块或聚集物的细胞悬液；单细胞悬液；完整的组织块。

完整的组织块常用于外科手术补洞的移植实验，如 Stenevi 等（1985) 所做的那样。此外，Soteb 和他的同事曾经把小脑原基的组织块植入小脑发育缺陷的小鼠脑内（Sotelo and Alvarado Malkrt 1987)。实验者应用整块组织的原因可能是在已知确切分化方向的情况下，希望保留移植物相对完整的结构。也有使用碎裂但没有完全分散的组织的先例（Bjorklimd and Dunnett 1992)。

本章重点讲述使用细胞悬液的方法。应用细胞悬液的一大优点就是可以将细胞悬液通过精确定位注射到靶点，例如，应用汉密尔顿注射器（Hamiltonsyringe) 或玻璃毛细管均可达到大脑深部位点（Bjdrklundetal.1980,1983)。应用细胞悬液还可以对注入各个部位的细胞数量及其生存能力做出直接的评估（Brundin et al.1985a;Nikkhah et al.1994a;Barker et al.1995)。

上述三种方式之中哪一种最好，要根据具体实验所要求的细胞种类、移植存活率和治疗效. 果具体而定下面给出的实验方法是作者实验室在工作中证明可行的。当然，随着工作的进一步开展，这些实验方法可能需要不断的修正。

为了得到细胞悬液，组织块通常需要经过机械分离和酶的消化。这个过程会影响到细胞的生存能力和移植的成功率，所以要尽可能地优化这一过程（Barkeretal.1995)。

例如，将胚胎多巴胺能神经元植入成体脑中时，只有 5%~20% 的细胞存活率（SauerandBrundin1991)，如果在分离过程中应用脂质过氧化反应的抑制剂，如拉扎碱类 (Iazaroids), 可以提尚植入细胞的存活率（Nakaoetal.1994)。最近，研究发现天冬氨酸特异的半腕氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease,caspase) 的抑制剂可以使移植到偏侧帕金森病大鼠模型脑内的多巴胺能神经元减少凋亡，提高其存活率 (Schierleetal.1999)。对于酶消化的过程来讲，Bjorklund 等（1986) 证实在制备来自蓝斑的去甲肾上腺素能神经元的过程中，只有不使用胰蛋白酶才能得到较好的移植存活率。此外，Olsson 等（1997) 发现将未经胰蛋白酶处理（即保持细胞表面分子完整）的神经节隆起细胞植入大鼠胚胎侧脑室，可产生更多的特异 rsquo;性同源整和。除了优化制备细胞悬液的过程之外，实验者现在开始尝试在移植前，用营养因子和选择性培养方法体外扩增中脑前体细胞的数量（Studeretal.1998)。

1.如上文所述分离得到胚胎组织，然后将组织块收集在盛有分离用培养基的 Eppendorf 管或小瓶中。

2.组织块在含有 0.1% 胰蛋白酶和 0.5%DNA 酶（deoxyribonuclease,DNase，Sigma) 的培养基中 371：赌育 20 min。

3.组织块用培养基小心地洗 4 次，以除去胰酶。

4.培养基的终体积用一个均值来衡量，如 10^1/块组织。向试管中加入含有 DNA 酶的培养基，根据需要的细胞悬液的浓度来确定加入的总体积，一般说来，分离下来的腹侧中脑应加培养基 5~6M1/块，每个神经节突起（LGE+MGE) 大约 5M1。

5.用巴斯德吸液管反复吹打组织块，使之在机械作用下形成乳状的细胞悬液。一般选择两种不同直径的吸液管。小心不要产生气泡。这样得到的细胞悬液中既含有单细胞也含有聚合物以及组织的小碎块。应避免吸管过度吹打，一般 10~15 次即可以达到较好的分离效果而不会对细胞造成过度的伤害（Bjorklund and Dunnett1992)。细胞悬液的浓度和生存能力可以用台盼蓝染料排斥法（Trypan blue dye exclusion method) 判断，或用吖陡橙（acridineorange) 或溴化乙陡（ethidiumbromide) 染色。用血细胞计数板完成细胞计数（BmndinetaL1985a)。

为了达到显微移植技术的要求，使注入的细胞悬液体积更少，应使用直径更小的玻璃毛细管移植细胞。因此，实验者对传统的制备细胞悬液的技术进行了改良（Nikkhahetal.1994a,b)。利用这种技术可以得到均匀的单细胞悬液，从而达到了精确估计悬液中细胞密度的目的，保证了移植细胞数量的可重复性。Nikkhah 等（1994a，b) 曾利用这一手段进行腹侧中脑移植，下面的实验方法就是基于这一实验。

1.组织块收集，胰蛋白酶消化，以及去除胰酶的方法，与制备细胞悬液时一样。

组织块与培养基的体积要适合吹打分离（250ul 或 500ul)，具体根据组织块的量来定。

2.组织块先用 1 mlEppendorf 移液器反复吹打，机械分离形成乳状细胞悬液。再用 200^1Eppendorf 移液器反复吹打形成均匀的单细胞悬液。之后，用血细胞计数板测量悬液细胞的浓度，在总体积已知的情况下，计算可知总细胞数。

3.600r/min 离心 5 min。

4.沉淀用 200ul Eppendorf 移液器在事先准备好的终体积培养基中重新吹打形成悬液。培养基的体积决定于细胞的总数及所需要的适当终浓度。例如，Nikkhah 等用 10(^1 培养基和 25 块腹侧中脑组织制成了终浓度每微升 100 000~150 000个细胞的悬液。

通过台盼蓝染料排斥法或吖啶橙/溴化乙啶染色，血细胞计数板进行细胞计数后，实验者发现新制备的细胞悬液有非常好的生存能力，如腹侧中脑组织的细胞悬液中有 90%~95% 的活细胞。在移植过程中，细胞悬液可以在室温下保存数小时而维持其生存能力，但随着时间的延长，生存能力会降低，这也与组织的种类和供体胎龄有关 (BmndinetaL1985a)。在大多数实验中，我们在移植过程中将细胞悬液放在冰上或冰箱里保存。

为了长期保存组织，可以在移植前促使组织冬眠，如腹侧中脑或神经节隆起可以保持数天（Sauer and Brundin 1991;Frodl et aL 1995;Grasbon-Frodletal.1996;Nikkhah et al.1995)。同样，在液氮中冻存也是可行的，但会显著降低移植后的存活率和功能。

本节重点讲述向成年受者脑实质中注射细胞悬液的方法，其他文献中有关于脑室移植（Freed1985) 和把组织块植入脑内移植用空腔的报道（Stenev1etal.1985)。

1.大鼠根据当地实验室方法麻醉。

2.大鼠置于立体定位仪上，使移植物得以精确定位，并可反复放置。

3.动物深度麻醉后，剃去头上的毛，用 70% 乙醇擦拭皮肤。用解剖刀片纵向切开头部皮肤，去掉颅骨表面的肌肉和结缔组织。

4.以前囟（bregma) 或后囟（lambda) 为基准点进行测量。文献中报道过许多损毁模型和不同移植位点的相关资料，包括立体定位的坐标和移植相关的各种特定参数, 如纹状体（Brundin et al.1985a)、黑质（Nikkhah et al.1994b)、海马（Bengzon et al.1990)、丘脑（Peschanski and Isacson1988)。在设计实验的过程中，建议读者在综述中査找相关数据，如 Bj6rklund 和 Dunnett 等（1994) 的文章。新的立体定位坐标也会在大鼠的脑片图谱中给出，如 Paxinos 等（1986,1997),Swanson(1992) 的文章, 小鼠的相关参数见 Franklin 和 Paxinos(1997) 的文献。

5.确定坐标后，用牙钻在颅骨上打出小孔，但应保持脑膜完整。

可选择一个精密的微量进样器，如 2/nl 或 IOfJHamilton 注射器（HamiltonBonaduz,Switzerland) 向移植位点注射细胞。细胞可以由一个内径适合细胞悬液通过的金属套管 (不锈钢针）直接注入脑内。为了缩小注射器尖端的直径以减少组织损伤及注射后细胞悬液的回流，Nikkhah 等（1994a) 做了一个外径为 50~7(Vm 的精密玻璃毛细管，套在注射器的针尖上，这个套管如图 14-7 所示。用一个标准的吸液管拉制器，把一个玻璃毛细管（内径 0.55 mm; 外径 1.0 mm) 拉成一个长径吸液管或毛细管，用一截聚乙烯套管（内径 0.58 mm; 夕卜径 0.965 mm) 做接头，连接注射器的金属套管（外径0.5 mm) 和玻璃毛细管，聚乙烯套管先用吹风机的热风轻微加热，然后拉成圆锥形封套，直径小的一头可以紧密地固定在金属套管上，再把玻璃毛细管和聚乙烯封套连接在一起 (Nikkhah et al.1994a)。

玻璃毛细管的最佳内径取决于所注射的悬液种类（Nikkhah et al.1994a)。对于均匀的单细胞悬液来讲，可以用直径很小的毛细管；含有聚集物或密度较高的细胞悬液要求毛细管的直径略粗，以避免阻塞；当注射完整的组织块时，要使用较大的注射器。

1.在移植过程中，我们通常把细胞悬液放在冰上或冰箱里，在使用前，如果发现有沉淀物，可以用吸液器轻柔吹打使之重新混悬。

2.抽吸充满注射器的针头或玻璃毛细管。使用连有玻璃毛细管的 Hamilton 注射器时，先移走针栓，向注射器和毛细管内注满培养基。注意不要在注射器或毛细管内形成气泡，要检查毛细管与聚乙烯套管连接的地方是否渗漏。使用玻璃毛细管的另一个好处就是在实际注射过程中，可以在显微镜下观察通过毛细管的细胞。

3.大部分实验中的垂直坐标是由脑膜表面开始计算的（图 14-8)。以 lyl/min 的速度注射细胞悬液，注射中间以极短暂的停顿，注射完毕之后，停针 2 min，缓慢拔出注射器。

4.缝皮或使用回形针闭合伤口。

一般认为 CNS 是免疫豁免区，这表示脑内的异体移植与体内其他部位相比有更高的存活率（Widner and Brundin1988;Sloan et al.1990;Widner1995)。移植后免疫反应的影响因素有许多，如供体和受者之间的差异程度 （同种异体 dgeneic)，即在同种动物的不同品系之间进行移植；同源性异种移植（concordant xenogeneic)，即种属较接近的供体和受者之间进行移植；非同源性异种移植（discordant xenogeneic), 即在种属差异较大的供体和受者之间进行移植]、脉管系统的来源、抗原呈递细胞的含量以及局部的免疫抑制因子等。在脑内，异体移植的存活率同样由供体的组织制备和移植位点决定。同种异体组织的细胞悬液及少数异种组织，在植入纹状体后有较高的存活率；但是，同样的移植物植入海马，或向脑室内移植组织块，则需要使用免疫抑制剂，否则会发生较强的免疫排斥反应（Widner1995)。

本章引用的大量研究所使用的是同源移植（syngeneicgraft)(在同品系的供体和受体之间进行移植)，一般不需要免疫抑制剂。将小鼠的组织植入大鼠体内，环孢菌素 A(cyclosporinA) 可以提高移植细胞的存活率（Brundinetal.1985b)。在作者的实验室，移植后给受者腹腔注射环抱菌素 A10 mg/kg(Sandimmun;Sandoz，Basel,Switzerland), 环孢菌素 A 溶解在聚乙二醇（cremophor) 和生理盐水中，终浓度为 10 mg/ml。在给予免疫抑制剂的前 10 天，需在动物的饮用水中添加抗生素（如 Borgal，Hoechst,Munich，Germany)。Pakzaban 和 Isacson(1994) 对神经系统异种移植后全身使用免疫抑制剂的效果做了分析，发现使用免疫抑制剂可以全面提高存活率至大约 75%, 而不使用免疫抑制剂其存活率则会降低到 30%。Pedersen 等（1995) 认为多种免疫抑制剂（环孢菌素 A、硝基咪哇、泼尼松龙）联合应用非常有效。

有效的免疫抑制方法有多种，但都不能减少并发症和费用。除了每天腹腔注射环孢菌素 A 外，还有几种单独用药的方法，也可以在 1 0~15 周内保持存活率而不会引起损伤，如每天注射甲基泼尼松龙（methylprednisolone)30 mg/kg(Duanetal.1996;Czechetal.1999)。最近推荐单独用药的改良方案为：每天口服泼尼松龙 20 mg/kg 或腹腔注射甲基泼尼松龙 lOmg/kg, 持续 2 周。小鼠受者最好使用抗淋巴细胞血清（anti-lym?phocytesera,ALS) 或单克隆抗体（monoclonalantibodies), 因为常规用药需要给很大的剂量（环孢菌素 A50~80 mg/kg), 毒性较大。抗体治疗通常容易耐受，可以腹腔给药，但需要每 3~5d 重复 1 次，并在移植前几天就开始给药。这种方法可能导致移植耐受（Woodetal.1996)。啮齿类动物的抗体治疗一般比较贵。

对任何移植来讲，如果受者是新生动物，可以自发地忽略移植物，形成免疫耐受 (Brent1990)。将小鼠视网膜植入新生大鼠脑内（LundandBanerjee1992)，可以存活 2 年之久；而同样的组织在成体受者脑中会很快被排斥。受体大鼠的年龄在 8-12d 之即，可以保证移植物存活而不受排斥（LundandBanerjee1992)。在作者的实验中，通常将小鼠细胞移植到出生后 1?2d 的大鼠脑内，获得了较好的效果。

在一些移植实验中，移植物可以在活体中检测其功能，如用微透析测量递质释放 (Campbelletal.1993)，行为测试（Dunnett1994) 或应用不同的脑成像方法 (Frickeretal.1997)。对于组织化学分析来讲，动物要先处死，然后根据后续分析方法的需要用特殊的方法做进一步的处理。为了进行详细的解剖学研究，动物在处死前通常会注射神经解剖示踪剂。分析移植物的方法还包括免疫细胞化学方法和原位杂交。现代组织学方法详见第十五章。

就作者实验室常规使用的免疫组织化学分析来讲，动物用大剂量戊巴比妥深度麻醉。之后通过心脏灌流固定大脑。在灌流时，先用生理盐水或磷酸盐缓冲液（phos_phatfrbufferedsaline,PBS) 做短暂的冲洗（Imin), 之后用 4% 多聚甲醛 (paraformaldehyde, 溶于 PB)250~300 ml 固定，根据接下来的分析需要后固定数小时或过夜。当脑块在 20% 蔗糖缓冲溶液中沉底后，用冰冻显微切片机切开，备用。

新生动物的移植实验在许多方面与成体移植实验是相同的，但也存在着一些不同点。本节提供的大部分实验是以新生早期大鼠为受者的，当然，也有其他实验者以出生后较晚的动物或其他种属动物为受者（LundandYee1992)。

如前所述，大鼠的妊娠期为大约 21~22d, 为了预先确定手术的日期，最好确知妊娠的时间。在孕鼠分娩前和分娩后，都要保持安静的环境。应激的动物容易早产，并可能吃掉它们的幼崽，即便在产后数天内，这种情况也可能发生。孕鼠应单笼喂养。出生当天被定为出生后 0 天（postnatalday0,PO), 作者的实验室通常使用出生后 l~3d 的大鼠。

1.在预先准备手术的时间里，幼崽离开母体的时间应尽可能短。

2.一次从母鼠身边取走几只幼崽到手术室中。处理幼崽的时候通常要戴手套，幼崽应放在柔软干净的地方，并有暖光照射，要避免过热和脱水。

3.低温麻醉，将幼崽淹没在冰水中 2~5 min，直至看不到反射和运动。具体的麻醉时间根据种属和年龄来确定。

由于新生鼠体积较小，很难做到正确定位和精细手术。在文献中，可以找到许多不同的供新生鼠手术用的装置。例如，Lund 和 Yee(1992) 记述了一种用光纤照明系统从动物下面照明的移植用手术台。通过透射光可以看到主静脉窦（major venous sinuses), 并以之作为基准，通过立体定位或目测完成移植。幼崽可以用模具等固定在一个确定的位置上。最近发明了小型低温立体定位仪（Cunningham and McKay1993)，可以用小号耳杆固定动物，调节耳杆相对于鼻子的角度，实施立体定位手术（图 14-9)。作者的实验室也使用了这种仪器。这种仪器可以单独使用，也可以固定在常用的成年动物手术台上使用。这种手术台有一个夹层，其中放置干冰和 70% 乙醇的混合物，以便在手术中保持动物的低温状态。

1.夹起头部皮肤，用解剖刀片或一把小剪刀轻柔地剪开皮肤，注意不要剪到颅骨以及正在形成颅骨的软骨，. 尤其不能伤及矢状窦。幼崽在整个手术过程中应保持低体温。

2.把幼崽放在手术台上，使用耳杆固定幼崽时，拉开皮肤，显露发育中的外耳道，轻柔地加上耳杆。

3.在作者的实验室，应用连有小直径玻璃毛细管的 Hamilton 注射器为新生动物注射细胞悬液，方法如上所述。其他研究者也有报道将大块或完整组织如视网膜或新皮质直接植入到一个脑内可达位点（LundandYee1992)。向大脑深部位点移植时，要尽量避免伤及硬脑膜和脑膜下的实质组织。

4.移植用的注射器可以固定在常规立体定位仪上，定位的方法与成体手术时在大仪器上的方法一致（图 14-9)。

5.填充注射器的方法与成体实验一样。注射量最大为每个位点 2ul; 小范围内，如海马，1ul 更好，最好分多个位点注射。

6.为小鼠注射细胞悬液时，最好使用纳升（nanoliter) 级体积，为了做到这一点，推荐使用直接连有玻璃毛细管的纳注射器，注射器既可以固定在成体动物用立体定位仪上也可用于连有立体定位仪的显微操纵台。小鼠可以用耳杆固定在新生大鼠的操作台上，否则，应使用模具固定头部。

7.手术完成后，用细线缝合中线上的切口，注意不要撕裂皮肤。缝线留下的线头要短，以避免被母鼠拆掉缝线。幼崽清除掉身上的血后，在灯下逐渐恢复体温。如果需要，可以轻压尾部以刺激呼吸。幼崽在回到母体身边时，应完全苏醒。

在研究发育的过程中，胚胎大脑的宫内细胞移植是非常有用的方法（Campbell et al.1995;Brustle et al.1995;FisheH 1995;Olsson et al.1997,1998a)。细胞可以通过手动注射移植到胚胎脑室中。使用更精密的仪器，如超声波辅助移植可以把细胞移植到受体胚胎的实质（Olssonetal.1997), 或神经管的空腔中（LiuetaL1998)。

宫内移植实验可以研究神经前体细胞在发育的特定阶段形成特定神经元类型的过程，以及局部环境在分化发育过程中所起的作用（如分化潜能)，为发育研究提供了独一无二的工具，宫内移植被用于前脑前体细胞移植实验，并与新生或成年受者的相关实验做出比较。研究者发现，妊娠中期胚胎端脑前体细胞异体移植至成年受者后，，移植细胞更倾向于分化形成在供者原位的细胞表型，而不是移植位点的细胞表型（Olsson et al.1995)。由于神经形成主要发生于出生前，成年和新生受者常缺乏引导前体细胞分化的一些具体环境，移植实验的结果表现出了很大的限制性。实际上，将妊娠中期的纹状体前体细胞通过宫内移植植入到相同时期胚胎受者的前脑脑室，可以清楚地发现这些前体细胞与之前所提到的植入成年或新生受者体内的前体细胞相比，有更高的分化潜 (Campbell et al.1995;Briistle et al.1995;Fishell 1995;Olsson et al.1997,1998a)。

移植到胚胎前脑脑室的前体细胞在发育大脑中的整合是不均匀的，所以，上述实验更倾向于验证不同区域对神经前体细胞分化的影响，而不是细胞在移植到不同区域后的分化能力。为了进一步证实神经前体细胞的分化情况，Olsson 等（1997) 利用高分辨率超声波反向散射显微镜（Tumbull et al.1995b), 建立了完备的超声波辅助宫内移植模式，以便于向 E12.5~13.5 小鼠胚胎中的发育区域进行实质内注射。这种超声波辅助胎注射技术也适用于向胚胎头褶刚刚闭合时（E9~9.5;LiuetaL1998) 的神经管空腔内注射细胞。

在作者的实验室，已经成功地实施了 E15-20 宫内大鼠胚胎脑室注射。在发育的后续阶段，胚胎充满子宫，前脑变得更清晰，也更适合移植。

1.为了缩短实际的手术时间，细胞悬液和移植过程中需要的所有配置均需在孕鼠麻醉前预先准备好。

2.动物背面向下放置，腹部用 70% 乙醇消毒，做中线剖腹手术，用消毒巾覆盖。

3.整个实验过程要保持无菌，一次移出一个子宫角。在对移出的子宫角进行操作时，用光纤发出的透射光照射子宫囊，使端脑泡和颅缝变得清晰。这样，随着胚胎的优化导向，前脑脑室清晰可见。

4.实验助手固定住胚胎，实验者用装有玻璃微量加液器的 10ul Hamilton 射器手动注射。注射在数秒内完成，针头在停留 5~10s 后拔出。为了提高胚胎存活率，在注射过程中，尽量不要让羊水渗漏出来。在移植后，子宫角放回腹腔内，缝皮并等待母鼠分娩。

1.选择妊娠 9.5~13.5d 的孕小鼠，麻醉后腹部沾湿去毛，做 2 cm 中线切口。小心地单独取出每一个子宫角，准备在一侧注射。将子宫角重新放置在腹腔内，胚胎在卵巢侧，待注射的一侧向着腹腔外。手术台分两层，将孕鼠放在下层，在培养皿的底部打一个直径 25_的洞，用薄塑料膜封住洞口（图 14-10)。培养皿安装在手术台上层，正对孕鼠的腹部。包含着第一个待注射胚胎的那部分子宫从塑料薄膜的裂缝中轻轻拉出来（Olsson et al.1997;Liu et al.1998)。培养皿里盛有消毒的含有转镁氯化物的磷酸盐缓冲液，作为组织和传感器之间的流动相。微毛细管的尖端在超声图像显示上是一个亮点，把 UBM 信号（图像亮度）调大，实验者可以在操作视野内控制针尖的位置。

2.在 UBM 辅助下，调整胚胎的位置，获取冠状面或水平面超声波图像，以便于皮质内注射。为了便于向早期神经管腔隙内注射，一般采取矢状面图像。在确定了实质内靶位点 (作者曾成功地向 LGE、MGE、小脑原基、顶盖、大脑被盖部注射）或神经管腔的位置之后，玻璃微毛细管插入子宫壁，向靶位点注射 1~2ul 细胞悬液。细胞悬液的反向散射信号非常高，实验者可以看到注入的细胞悬液在实质靶位点中扩散，或填充于脑室的空隙中。在注射完一个胚胎后，从塑料薄膜的缝隙里轻轻抽出第二个胚胎，摆好位置准备注射，同时将第一个胚胎放回腹腔中。按照这种方法，可以在 30~60 min 内注射完一侧子宫角上的所有胚胎（4~10)。为了在下一步实验中辨别各个胚胎，每一个注射过的胚胎均需标记。在注射完毕后，将子宫角放回腹腔内，给动物缝皮。