通善 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 实验技术服务

基因组DNA提取

通善 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 实验技术服务

酵母双（单）杂交cDNA文库构建

1. 服务流程

1.1 客户样品QC

1.2 Total RNA的提取。

1.3 mRNA的分离。

1.4 以mRNA为模板进行cDNA双链的合成。

1.5 对合成的cDNA双链进行分级纯化。

1.6 将分级纯化的cDNA与pDONR222载体进行重组反应。

1.7 将重组产物转化DH10B感受态细胞。

1.8 cDNA文库的QC。

a) 检测文库库容量。

b)随机挑取32个克隆子，PCR检测平均插入片段大小，阳性率。

1.9 初级文库铺板，抽提质粒

1.10 初级文库质粒与PDEST22（或者pGADT7,pGADT7-Rec,pGADT7-Rec2, PCDNA3.1 或者其他任意指定

载体，根据客户需求确定载体）载体进行重组反应，电转化，检测文库质量。

a) 检测文库库容量。

b)每个文库随机挑取32个克隆子，PCR检测平均插入片段大小，阳性率。

2.送样要求

2.1 针对每个文库，客户需提供至少能提取500ug总RNA的样本，或者至少500ug总RNA。

3.发货内容

3.1 我们提供构建好的酵母文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基），扩增后初级文库甘油菌，初级

文库中抽质粒，随机克隆子的PCR鉴定图谱，文库构建报告，酵母双杂交筛选相关细胞和质粒。

4.质量标准

4.1 文库库容量：大于1*10^7 CFU。

4.2 平均插入片段：大于1.2Kbp。

4.3 阳性率：大于95%。

5.服务时间

30个工作日内

收费：人民币30000.00

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基因甲基化检测

甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中，是最早发现的修饰途径之一，是表观遗传学（Epigenetics）的重要组成部分。大量研究表明，DNA甲基化不改变DNA的一级结构，但是能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而在基因的表达及其调控、DNA的复制、细胞的生长发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病 （如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等）发生过程中发挥重要作用。 DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶和少量的N6-甲基腺嘌呤及7-甲基鸟嘌呤。在高等生物中，5-甲基胞嘧啶多发于CpG二核苷酸序列中，基因组中60%-90%的CpG是甲基化的。在甲基转移酶（DNMT）的催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基，使CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，高等真核生物中CpG序列远远低于其理论值，但在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子和第一外显子区，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。哺乳类基因组中约存在4万个CpG岛，大多位于转录单元的5’区。CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。

服务项目：

1．甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

通善 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 实验技术服务

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生甲基化。

2．亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，未尾对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

特点：精确度高，能够准确检测出甲基化的程度百分比。

送样要求：

细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。

服务价格：