一、实验流程
制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料
（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统， 组成为穿梭质粒（ 包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP 和pHBAd-U6-GFP 能表达绿色荧光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP 和 pHBAd-U6-RFP 能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息
1) 腺病毒克隆载体图谱如下： 各载体用途如下表：
2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A 细胞的培养
（一） 293A 细胞的冻存
细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表 型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A 细胞则能连续培养3~4 个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293A 作为第一代，则30 代内能得到最佳结果。随着传代的次数增加，293A 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻 存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS 洗去残留的培养基；
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 预热的 10%DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10% DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20 S+10%DMSO），重悬细胞，密度为3 x 106 个/ml。
6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80 超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。
（二）293A 细胞的传代
当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况，将细胞分到10cm 培养皿中，每个培养皿补足到10ml 培养基。
4、将培养皿平稳放回37 、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
（三）293A 细胞的复苏
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为37~42 的水浴。
2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min 内使细胞溶液完全溶解。
3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中，并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。
4、去掉上清，加入5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm 培养皿。
5、将培养皿平稳放入37 、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。 四、腺病毒包装、扩增和纯化
（一）腺病毒包装
事先准备好用于包装病毒的293A 细胞和病毒质粒，转染每个直径为6cm 的培养皿complex 成分如下：
穿梭质粒 2μg
p-BHG(delta)E1,3 cre 4μg
转染后6h 换新鲜培液。
（二）病毒收集
病毒收集前要观察病毒空斑是否形成，为限制病毒的扩散及空斑更好的形成，通常在培养液中加入琼脂糖，感染后7 天左右可以在显微镜下看到小的空斑，一般在10 至21 天内形成，空斑形成后连着琼脂糖一起将空斑挑起，放入新鲜培养基中过夜。
（三） 病毒扩增
第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A 细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1 代病毒，以P1 代腺病毒感染293A 细胞，连续进行三代感染，至P4 代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。
（四）病毒纯化
病毒纯化采用CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，CsCl梯度的制备方法如下：加入2.0ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液（溶剂同 上），然后缓慢加入3.0ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml的病毒悬浮液。20000rpm，室温离心2小时。收集密度在 1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中（透析袋使用前用10mM的EDTA－Na2煮沸10min）。在透析缓冲液（50g蔗 糖，10ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2ml 1M MgCl2定容至1L）中，4 搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。
（五）病毒重悬和保存
500ul PBS 重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 度冰箱保存，如需长时间存放需置于-80 度甚至液氮保存。
五、感染目的细胞
因为不同细胞的MOI 不同，所以在将病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。
（一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24 孔板，使细胞浓度为1 105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。
（二）病毒感染
I、贴壁细胞
感染实验分为两组，分别添加相应腺体病毒载体和等滴度同体积的对照病毒载体。加入的病毒量范围在MOI=20～50 内，每个MOI 值加两个孔 24 小时后换液。
II、悬浮细胞
上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后， 低速离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分 上清，然后加入适量的病毒液，室温放置10min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染即可。
（三）观察感染情况
感染24 小时后， 可以开始观察到GFP/RFP表达（ 只对于有GFP/RFP独立表达框的腺病毒载体），过表达和干扰的感染时间以36-48小时实验为最佳。
六、动物实验
将纯化过的腺病毒以每只小鼠 1-5 109毒量注射，比如纯化腺病毒滴度为 1 1011PFU，则每只小鼠注射体积约为 10-50ul。具体的注射量需要实验摸索，注意注射体积不要超过 200ul，最好控制在100ul以下，注射剂量过多，也会发生充血性心衰。