【汉恒干货·CRISPR protocol】Cas9敲除系统操作方法（一）
前言lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布的一个慢病毒载体，cas9和sgRNA表达框在同一个载体上，而且Cas9的C端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建系。验证sgRNA活性的时候也适合瞬转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系，构建非常方便。 ![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/C1503627011201qvj3qnyttzpng_small.jpg\")
一、lentiCRISPR v2应用指南网址：https://www.addgene.org/52961/![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/C1503627099711qqbqk9d6zzpng_small.jpg\")
1、克隆gDNA使用BsmBI位点，载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段，便于confirm酶切成功并利于载体回收；2、BsmBI的位点是![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/C1503627166380knhujipyftpng_small.jpg\")
，酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连！3、Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB或者Immunostaining4、EFS promoter被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率5、载体带有Puromycin抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。二、如何设计gDNA1、gDNA设计方法和原则请参考上第一步\"lentiCRISPR v2应用指南”，链接如下： https://www.addgene.org/52961/2、对于lentiCRISPR v2克隆，其合成的oligo末端和pX330不同，请注意设计；![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/B15036273376477bnja3ebx8png_small.jpg\")
举个例子说明（克隆小白千万注意oligo的方向）![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/C15036273671353by4w236rtpng_small.jpg\")
三、如何克隆载体1、Backbone的酶切体系同上方步骤\" 如何设计gDNA\"（说明：不脱磷处理参考黑框，脱磷参考红框内操作）2、Oligo的退火条件也参考上方步骤（说明：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo就需要加磷处理![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/B15036291222027pzwfsjxg4png_small.jpg\")
图1![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/C1503629155444q7x5ppcgthpng_small.jpg\")
图2四、病毒包装体系1、包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish，6x106 293T）![\"\"](\"http://img.ebiomall.cn/images/308/B1503629198082c8qj42u35zpng_small.jpg\")
2、转染条件：用细胞转染试剂 LipoFiterTM（超便宜且好用）（汉恒生物LipoFiterTM官方页面， http://www.hanbio.net/cn/products/item/36）3、收集48hr和72hr病毒上清，待用。病毒包装的protocol非常多，小编只列了基本的信息。后续会出详细写慢病毒包装步骤的干货！
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