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抗原特异Ｔ细胞预富集,提高细胞分析灵敏度

2025-06-14

抗原特异Ｔ细胞预富集,提高细胞分析灵敏度

Miltenyi Biotec发布时间：2020/03/06 17:30 点击: 加载中..

抗原特异性T细胞(Antigen-specific T cells)是研究免疫系统的独特工具。一但经外来病原体或肿瘤侵入活化免疫系统，抗原特异性T细胞通过自身T细胞受体 (T cell receptor, TCR)识别肿瘤抗原，具有选择性识别肿瘤抗原、分裂增殖和持续提供长期免疫保护的能力，在治疗病毒感染疾病和恶性肿瘤方面具有许多潜在的益处；因此在肿瘤免疫治疗与疫苗开发上为一重要的细胞研究方向。

抗原特异性T细胞活化过程。T细胞经由细胞受体 (TCR) 识别多肽抗原后活化特定细胞表面标记物 (CD25, CD137, CD69 or CD154), 释放细胞因子与克隆扩增成为抗原特异性T细胞。

T细胞受体(TCR)和免疫球蛋白一样，是由多个基因片段的基因重组产生的。这种重组产生了大量的T细胞，每一个都针对一种独特的多肽抗原 (peptide antigen)。T细胞对病毒、细菌、肿瘤细胞以及来自正常组织的多肽（在自身免疫性疾病中）有反应。每个多肽的特异性只在循环T细胞的一小部分中被发现，这使得抗原特异性反应的研究变得困难。

如何检测抗原特异性T细胞？

细胞稀有性

分析抗原特异性T细胞最困难的挑战来自于细胞的稀有性，这是因为细胞来源自不同的个体捐赠者以及多样的特异性抗原所活化后的T细胞，抗原特异性T细胞仅占所有T细胞群体里0.1 – 0.001%，属于稀有细胞群 (低频细胞)。在实验研究初期，也会因为起始材料来自不同组织来源(如肾或外周血)增加分离细胞的困难度。

不同T细胞类型，检测方法不同

CD4+T细胞识别MHC II主要组织相容性复合体，CD8+T细胞则识别MHC I主要组织相容性复合体。如前所述，因不同的MHC在选择检测方法上也有所限制。

检测细胞表面标记物与细胞因子的选择策略

细胞表面标记物表现量因抗原递呈活化T细胞时间会有不同。CD69属早期活化的标记物(3-15小时)，但不仅表现在活化后的T细胞，也可在其它细胞上发现。CD137属早期活化的调节性T细胞(Treg)标记物 (4-6小时)，但可作为CD8+conventional T cell (Tcon)标记物 (16-24小时)。CD154则可作为CD4+Tcon细胞标记物(4-12小时)。同样地，细胞因子的释放也会随细胞种类不同而有不同图谱。

MACSQuant® 流式细胞分析仪预富集抗原特异性CD4+T细胞深入分析

埃博拉病毒疫苗诱导的循环滤泡T辅助细胞

滤泡辅助T细胞(Follicular T helper cells, Tfh)为一T细胞亚群，它们被认为是B细胞最主要的辅助细胞，是淋巴组织中重要的效应T细胞亚群之一。Tfh主要的识别标记物CXCR5，是淋巴细胞进入淋巴组织B细胞室所必需的一种趋化因子受体，而其他标记如CXCR3和CCR6则被用来鉴定Tfh亚群。

外周血PBMC经由埃博拉病毒片段(ZEBOV-GP)诱发APC并活化滤泡辅助T细胞(Tfh)。利用MACSQuant® 流式细胞分析仪预富集抗原特异性CD4+T细胞，再针对抗原特异性T细胞表面标记物(CD154, CXCR3, CXCR5)进行分析。滤泡辅助T细胞经埃博拉病毒片段刺激后，经预富集功能，CD4+T细胞可由2.57%提升至51.12%，增加低频细胞可分析数量，提高实验数据可信度。最终分析获得抗原特异性CXCR5+細胞亚族群 (cTfh1)细胞、CCR6 (cTfh17)与cTfh2细胞表现量。

滤泡辅助T细胞经埃博拉病毒片段刺激后，经预富集功能，CD4+T细胞可由2.57%提升至51.12%，增加低频细胞可分析数量，提高实验数据可信度。

滤泡辅助T细胞流式细胞分析的圈门策略

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使用预富集功能提高稀有细胞检测灵敏度

MACSQuant® 流式细胞分析仪内建MACS磁力柱装置与预富集模块功能，可对低频细胞在分析前进行预富集，高灵敏度地检测稀有细胞，极大的提高了流式分析稀有细胞的能力。

MACSQuant® 流式细胞分析仪预富集后分析流程

将目的稀有细胞以抗体磁珠标记，再对其他分析标记物进行不同多色荧光标记(Sample treatment)，直接上样流式细胞仪(Load sample)。先使用预富集模块功能，在内建的磁力柱上富集目的稀有细胞 (MACS enrichment)，随后进行细胞分析(Flow analysis)，不因过多操作流程而损失细胞，同时获得更多分析数据。

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参考文献:

1. Guidelines for the useof flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973

2. Circulating follicular Thelper cells and cytokine profile in humans following vaccination with therVSV-ZEBOV Ebola vaccine.Sci Rep. 2016 Jun21;6:27944

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