本发明涉及硫酸乙酰肝素，其包括结合FGF2的硫酸乙酰肝素，特别涉及其在皮肤修复和/或再生中的治疗用途，但不限于此。

背景技术：

皮肤构成人体最大的器官，作为保护屏障抵挡人身伤害，辐射和温度。皮肤由在下面的间质(真皮)层和外部上皮(表皮)层组成。

皮肤伤口愈合由各种机制调节，包括细胞-细胞相互作用，细胞外基质产生和许多细胞因子和生长因子(见Paul Martin.伤口愈合-旨在完美的皮肤再生\"Wound Healing-Aiming for Perfect Skin Regeneration”.Science 276(75)1997)。伤口治疗的重要目的包括快速伤口闭合以及在功能和美观上令人满意的瘢痕。

皮肤的伤口愈合通过诸多事件的重叠模式进行，包括凝血，炎症，组织形成(上皮形成，肉芽组织形成和基质形成)和组织重塑。修复过程在很大程度上是通过相互作用的分子信号，主要是细胞因子介导的。初始损伤引发凝血和急性局部炎症反应，随后是间充质干细胞募集，增殖和基质合成。不能解决炎症可导致慢性非愈合伤口，而不受控制的基质积累可导致过度瘢痕形成。

已知对皮肤伤口愈合至关重要的主要生长因子之一是成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，其属于由包括成纤维细胞，黑素细胞，内皮细胞在内的许多类型细胞，特别是干细胞生成的类肝素结合蛋白家族。FGF-2在多种发育和生物过程中起作用，包括肢体发育，组织修复，中胚层诱导，肺发育和维持神经元存活；特别地，FGF-2调节细胞增殖，迁移和分化，包括真皮和表皮。FGF-2变体已获得食品和药物管理局(FDA)批准用于数个III期临床试验，包括外周血管生成。FGF-2对角质形成细胞具有增殖和运动两种作用，并且增强皮肤衍生的间充质干细胞的活性。FGF-2也是原癌基因，使其在高浓度下的使用成为问题，因此需要替代疗法。

FGF-2在伤口愈合过程中对角质形成细胞具有增殖和运动作用，并增加皮肤衍生的间充质干细胞。FGF-2治疗对于被辐射的皮肤的修复是有效的。其用作二度烧伤创面的局部治疗也已被评估，其中确定了伤口愈合明显更快以及最大瘢痕延伸更大，瘢痕缩回至最大瘢痕延伸率和弹性。还通过诱导肌成纤维细胞凋亡来支持无疤痕伤口愈合，但对成纤维细胞具有相同的作用。

再上皮化是人类皮肤伤口愈合中的关键事件，其中表皮角化细胞从旁迁移以闭合伤口。在慢性伤口中，角质形成细胞迁移被阻止，伤口保持开放，导致患者发病，甚至死亡。在人类皮肤伤口愈合期间，重要的步骤是在伤口边缘引起表皮和真皮细胞迁移到伤口床。人角质形成细胞(HKC)从切割边自侧面迁移穿过伤口床，以最终闭合伤口(再上皮化)。真皮细胞，包括真皮成纤维细胞(DF)和真皮微血管内皮细胞(HDMEC)，在HKC迁移后移入伤口，在此这些细胞沉积基质蛋白质，收缩和改造新近闭合的伤口并建立新的血管。

Brickman等(糖生物学\"Glycobiology”，卷8，第463-471页，1998年)描述称为HS2的硫酸乙酰肝素能够与FGF2相互作用。如Brickman(同上)所述，可以从10天胎龄的鼠细胞的乙酰肝素蛋白聚糖获得。HS2已被描述为具有分子量约25kDa，因此，假设每个二糖平均分子质量400Da，由约60个二糖组成。HS2的二糖组成列于Brickman等(糖生物学\"Glycobiology”，卷8，第463-471页，1998年)、WO2010/01185，其全部内容通过引用并入本文。HS2的亚硝酸和乙酰肝素裂解酶消化曲线如图29和30所示。

Maccarana等(碱性成纤维细胞生长因子结合所需的硫酸乙酰肝素/肝素中的最小序列\"Minimal Sequence in Heparin/Heparan Sulfate Required for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor”.生物化学学报.卷268,32号,15期,23898-23905页,1993)描述研究由人主动脉肝素或HS产生的几种小寡糖结合FGF-2的实验。使用一个八糖部分(B2)归为八糖的结构，作者称之为HS-8。应当注意，这不是本发明的HS-8，并且命名完全是巧合。

来自猪肠粘膜的肝素，选择性O-脱硫肝素的两个样品，其中一个样本通过原料的优先6-O-脱硫和N-脱硫然后再N-硫化获得，另一个样本在碱性条件下通过选择性2-O-脱硫获得，从人主动脉分离的低硫酸化HS和来自牛肾的HS用于产生偶数或奇数的低链长寡糖。

通过用亚硝酸进行部分脱氨裂解解聚由肝素产生偶数寡糖，并且所得到的2,4-脱水-D-甘露糖残基用NAB3H4还原。分离标记的寡糖以产生来自4-14个糖的偶数物质和含有20-24个糖的组分。类似处理选择性6-O-脱硫肝素以获得4-至12-糖。分离和脱盐的寡糖进行轻度酸处理。用肝素酶I进一步处理20-24-聚糖获得奇数肝素寡糖。

4-14-聚低聚糖通过不同的策略从人主动脉HS产生，涉及在N-乙酰化GlcN单位占据的部位进行切割。样品经N-脱乙酰化，然后用亚硝酸脱氨。这种处理导致未取代的GlcN单元脱氨和氨基糖胺键的切割，而N-硫酸化GlcN单元保持完整。产品包括GlcA-[1-3H]aManR二糖(衍生自(-GlcNAc)-(GlcA-GlcNac)n-序列)和GlcA-GlcNSO3-HexA)n-[1-3H]aManR寡糖(衍生自(-GlcNac)-GlcA-(GlcNSO3-HexA)n-GlcNac-序列)。

通过这些处理产生的寡糖都是短的和经它们的制备方法化学修饰，该方法将它们与本发明的HS区分开。

技术实现要素：

本发明涉及一种硫酸乙酰肝素制剂，硫酸乙酰肝素HS8。已经发现HS8结合FGF2并增强干细胞的增殖，同时保持它们的多能性/多潜能性。HS8是指一类新型的结构和功能相关的分离的硫酸乙酰肝素。本发明人已经鉴定了HS8类的几个密切相关的成员，这些成员具有结合衍生自FGF2的肝素结合域的共同特性并且共享短共有序列(YCKNGGF)。HS8类成员能够刺激干细胞的增殖并富集集落形成单位。

在本发明的一个方面，提供硫酸乙酰肝素HS8。HS8可以以分离的形式或基本上纯化的形式提供。这可以包括提供组合物，其中硫酸乙酰肝素组分为至少80％HS8，更优选至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。

在优选的实施方式中，HS8能够结合具有YCKNGGF(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的肽或多肽。该肽可以在该序列的一端或两端具有一个或多个另外的氨基酸。例如，肽可以在该序列的一端或两端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多的氨基酸。

在一些实施方式中，HS8能够结合具有以下任何一个氨基酸序列或由其组成的肽或多肽：

·YCKNGGF(SEQ ID NO：2)，或

·GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO：1)。

在其它实施方式中，多肽是FGF2蛋白。在一些实施方式中，HS8结合具有SEQ ID NO：1或2中任何一个氨基酸序列或由其组成的肽或结合FGF2蛋白，KD小于100μM，更优选小于50μM、40μM、30μM、20μM或10μM。

可以根据本文所述的发明人的方法获得，鉴定，分离或富集HS8，其可以包括以下步骤：

(i)提供具有多肽分子的固体支持物，该多肽分子粘附到该支持物上，其中所述多肽包含具有YCKNGGF氨基酸序列的肝素结合结构域；

(ii)使多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触，使得允许形成多肽-糖胺聚糖复合物；

(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的其余部分分离；

(iv)从多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；

(v)收集解离的糖胺聚糖。

在一些实施方式中，粘附到支持物上的多肽可以包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：

·YCKNGGF(SEQ ID NO：2)，或

·GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO：1)。

在本发明人的方法中，混合物可以包含从市售来源获得的糖胺聚糖。一种合适的来源是硫酸乙酰肝素级分，例如市售的硫酸乙酰肝素。在从猪肠粘膜分离肝素期间可以获得一种合适的硫酸乙酰肝素级分(例如塞尔苏斯(Celsus)实验室公司-有时称为\"Celsus HS”)。

其他合适来源的硫酸乙酰肝素包括来自任何哺乳动物(人或非人)的硫酸乙酰肝素，特别是来自肾，肺或肠粘膜。在一些实施方式中，硫酸乙酰肝素来自猪(猪的)或牛(牛科动物)肠粘膜，肾或肺。

在本发明的另一方面，提供了包含上述任一方面的HS8和FGF2蛋白的组合物。

在本发明的一个方面，提供了包含根据上述方面的HS8的药物组合物或药物。药物组合物或药物还可以包含药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂。

在一些实施方式中，药物组合物用于治疗方法，所述方法包括修复和/或再生组织，例如，断骨。在一些实施方式中，药物组合物或药物可进一步包含FGF2蛋白。在一些实施方式中，药物组合物或药物可进一步包含间充质干细胞。

在本发明的另一方面，提供HS8用于医疗方法。医疗方法可以包括体内伤口愈合、组织的修复和/或再生、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生、和/或哺乳动物或人类的骨的修复和/或再生的方法。

在本发明的相关方面，提供HS8在制备用于医疗方法的药物中的用途。在一些实施方式中，医疗方法包括哺乳动物或人中断骨的修复和/或再生。

在本发明的另一方面，提供包含生物材料和HS8的生物相容性植入物或假体。在一些实施方式中，植入物或假体用HS8涂覆。在一些实施方式中，植入物或假体用HS8浸渍。植入物或假体可以进一步用FGF2蛋白和/或与间充质干细胞包被或浸渍。

在本发明的另一方面，提供形成生物相容性植入物或假体的方法，所述方法包括用HS8涂覆或浸渍生物材料的步骤。在一些实施方式中，该方法还包括用FGF2蛋白和间充质干细胞中的一种或两种涂覆或浸渍生物材料。

在本发明的另一方面，提供了一种治疗患者骨折的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的HS8。在一些实施方式中，该方法包括将HS8施用于骨折周围的组织。在一些实施方式中，该方法包括将HS8注射到骨折周围的组织。在这种方法中，HS8可以配制成包含HS8和药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂的药物组合物或药物。

在一些实施方式中，该方法还可以包括向患者施用FGF2蛋白。在这些方法中，HS8和FGF2蛋白可以配制成包含HS8和FGF2蛋白质和药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂的药物组合物。

在一些实施方式中，该方法还可以包括向患者施用间充质干细胞。在这些方法中，HS8，FGF2蛋白和间充质干细胞中的至少两种可以配制在包含HS8，FGF2蛋白和间充质干细胞中的至少两种和药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂的药物组合物中。

优选地，以治疗有效量分别提供HS8，FGF2蛋白和间充质干细胞。在一些实施方式中，治疗骨折的方法还包括将治疗有效量的HS8、和/或FGF2蛋白和/或间充质干细胞配制为包含HS8、和/或FGF2蛋白和/或间充质干细胞和药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂的药物组合物的步骤，其中，药物组合物施用于患者。

在本发明的另一方面，提供一种治疗患者骨折的方法，所述方法包括将生物相容的植入物或假体经外科手术植入患者的组织中折裂部位或周围，所述植入物或假体包括生物材料和HS8。

在一些实施方式中，植入物或假体用HS8涂覆。在一些实施方式中，植入物或假体用HS8浸渍。在一些实施方式中，植入物或假体进一步用FGF2蛋白和间充质干细胞中的一种或两种浸渍。

在本发明的另一方面，提供了一种用于在需要这种治疗的人或动物患者中修复，替换或再生组织的方法，所述方法包括：

(i)在体外与HS8接触下，培养间充质干细胞足以使所述细胞形成组织的时间；

(ii)收集所述组织；

(iii)将所述组织植入患者体内的损伤或疾病部位以修复，替换或再生患者组织。

组织可以是结缔组织，例如骨，软骨，肌腱或脂肪。

在一些实施方式中，所述方法还包括使培养中的间充质干细胞与外源性FGF2蛋白质接触。

在本发明的另一方面，提供通过在HS8存在下体外培养间充质干细胞获得的组织。在一些实施方式中，在HS8和FGF2蛋白存在下通过体外培养间充质干细胞获得组织。

在本发明的另一方面，提供了诸部分构成的试剂盒，该试剂盒包含预定量的HS8和预定量的FGF2。试剂盒可以包含含有预定量的HS8的第一容器和含有预定量的FGF2的第二容器。试剂盒还可以包含预定量的间充质干细胞。该试剂盒可用于医疗方法中。医疗方法可以包括体内伤口愈合、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生，和/或哺乳动物或人的骨的修复和/或再生的方法。该试剂盒可以与用于分别、依次或同时施用HS8、FGF2蛋白和/或间充质干细胞的说明书一起提供，以提供医疗。

在本发明的另一方面，提供产品，所述产品含有治疗有效量的：

(i)HS8；和下组之一或两者

(ii)FGF2蛋白；

(iii)间充质干细胞，

同时，分开或顺序用于医疗方法中。医疗方法可以包括体内伤口愈合、结缔组织的修复和/或再生、骨的修复和/或再生、和/或哺乳动物或人类的骨的修复和/或再生的方法。产品可以任选地配制成用于共同给药的组合制剂。

在本发明的一个方面，提供硫酸乙酰肝素HS8用于皮肤修复和/或再生的治疗方法。在本发明的另一方面，提供硫酸乙酰肝素HS8在制备用于皮肤修复和/或再生的治疗方法的药物中的应用。在本发明的另一方面，提供了一种皮肤修复和/或再生的治疗方法，所述方法包括将硫酸乙酰肝素HS8施用于需要治疗的受试者。

在一些实施方式中，治疗方法可包括皮肤伤口或瘢痕，任选地选自皮肤灼伤，溃疡，切除伤口，切割，刺伤或穿刺伤口的治疗。在一些实施方式中，治疗方法可以包括皮肤移植愈合，皮肤重建或皮肤整形手术。

在本发明的另一方面，提供了一种愈合皮肤伤口的方法，所述方法包括使皮肤伤口与有效量的包含HS8的药物组合物接触。在本发明的另一方面，提供硫酸乙酰肝素HS8用于治愈皮肤伤口的方法，所述方法包括使皮肤伤口接触有效量的包含HS8的药物组合物。在本发明的另一方面，提供硫酸乙酰肝素HS8在制备用于治愈皮肤伤口的方法中的药物中的用途，所述方法包括使皮肤伤口与有效量的包含HS8的药物组合物接触。

在本发明的另一方面，提供治疗有皮肤伤口的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的硫酸乙酰肝素HS8，导致伤口处皮肤修复和/或再生。在本发明的另一方面，提供硫酸乙酰肝素HS8用于治疗具有皮肤伤口的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的硫酸乙酰肝素HS8施用于受试者导致伤口处皮肤修复和/或再生。在本发明的另一方面，提供硫酸乙酰肝素HS8在制备用于治疗有皮肤伤口的受试者的方法的药物的用途，所述方法包括将治疗有效量的硫酸乙酰肝素HS8施用于受试者导致伤口处皮肤修复和/或再生。在一些实施方式中，皮肤伤口是皮肤灼伤，溃疡，切除伤口，切割，刺伤或穿刺伤口。

在本发明的另一方面，提供皮肤移植、皮肤重建或皮肤整形手术的方法，所述方法包括将移植，重建或整形手术区域或其附近的皮肤与有效量的包含HS8的药物组合物接触。在本发明的另一方面，提供硫酸乙酰肝素HS8用于皮肤移植，皮肤重建或皮肤整形手术的方法中，所述方法包括将移植，重建或整形手术区域或其附近的皮肤与有效量的包含HS8的药物组合物接触。在本发明的另一方面，硫酸乙酰肝素HS8在制备用于皮肤移植，皮肤重建或皮肤整形手术的方法中的药物中的用途，所述方法包括将移植，重建或整形手术区域或其附近的皮肤与有效量的包含HS8的药物组合物接触。

在本发明的另一方面，提供HS8用于皮肤无疤痕伤口愈合的方法。在本发明的另一方面，提供了HS8在制备用于皮肤无疤痕伤口愈合方法中的药物中的用途。在本发明的另一方面，提供了一种皮肤无疤痕伤口愈合的方法，所述方法包括将硫酸乙酰肝素HS8施用于需要治疗的受试者。

在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗受试者中皮肤或表皮伤口的方法，所述方法包括向受试者施用包含HS8的药物组合物。在本发明的另一方面，提供硫酸乙酰肝素HS8用于治疗受试者中皮肤或表皮伤口的方法。在本发明的另一方面，提供了硫酸乙酰肝素HS8在制备用于治疗受试者的皮肤或表皮伤口的方法中的药物中的用途。

在一些实施方式中，HS8或含有HS8的药物或药物组合物可以配制用于局部或透皮给药。在一些实施方式中，HS8或包含(其)的药物或药物组合物可以配制成凝胶，喷雾剂，糊剂，软膏，乳膏，洗剂，盐水，油，水溶液，悬浮液，分散体，贴剂，粘合剂膏剂，绷带，敷料，或贮液囊。

在一些实施方式中，所述方法/治疗可进一步包括施用生长因子，优选FGF2，和/或间充质干细胞。在一些实施方式中，HS8、或药物或药物组合物与生长因子，优选FGF2，和/或与间充质干细胞一起配制为联合制剂。

本发明的其它方面如下。

在本发明的一个方面，提供了对FGF2具有高结合亲和力的GAG。更优选GAG是硫酸乙酰肝素(HS)。在一个实施方式中，通过采用本文描述的方法从自猪肠粘膜获得的GAG混合物中分离HS(可得自塞尔苏斯实验室公司，辛辛那提，美国，如INW-08-045，硫酸乙酰肝素I，塞尔苏斯实验室公司，HO-03102，HO-10595，10×100mg)，其中包括含有YCKNGGF氨基酸序列的FGF2肝素结合结构域的多肽连接到固体支持物，允许形成GAG-多肽复合物。从GAG-多肽复合物分离GAG组分导致本文称为\"HS8”的独特HS的分离。在一个实施方式中，HS8是通过将多肽GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO：1)连接到固体支持物，允许GAG-多肽复合物形成，并从GAG-多肽复合物解离GAG组分而分离的HS。

本发明人认为，HS8可以从由多种来源，包括哺乳动物(人和非人)组织和/或细胞外基质获得的HS级分获得。

因此，在本发明的一个方面，提供了HS8。HS8可以以分离或纯化形式提供。在另一方面，提供了包含HS8的培养基。

在本发明的另一方面，提供包含HS8的药物组合物或药物，任选地与药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂组合。在一些实施方式中，药物组合物或药物可进一步包含FGF2蛋白。提供包含HS8的药物组合物或药物用于预防或治疗损伤或疾病。还提供了HS8在制备用于预防或治疗损伤或疾病的药物中的用途。

在本发明的另一方面，提供了预防或治疗有需要的患者的损伤或疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的HS8。施用的HS8可以配制在合适的药物组合物或药物中，并且还可以包含药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂。任选地，药物组合物或药物还可以包含FGF2蛋白。

在本发明的另一方面，提供促进或抑制骨形成(骨细胞和/或骨组织的形成)的方法，包括将HS8施用于骨前体细胞或骨干细胞。

在本发明的另一方面，提供了促进或抑制软骨组织形成(软骨形成)的方法，包括给予HS8至软骨前体细胞或软骨干细胞。

刺激或抑制骨形成或软骨组织形成的方法可以在体外通过使骨或软骨前体或干细胞与HS8接触，任选地在外源性加入的FGF2蛋白的存在下进行。前体细胞或干细胞可以是间充质干细胞。在促进组织形成的情况下，可以收集形成的组织并将其用于植入人或动物患者。

因此，在本发明的一个方面，提供结缔组织，其中通过在HS8(即外源性HS8)存在下，并且任选地在FGF2(即外源性FGF2)存在下体外培养间充质干细胞获得结缔组织。结缔组织可以是骨，软骨，肌肉，脂肪，韧带或腱。

使用HS8预防或治疗疾病可能涉及组织的修复，再生或替换，特别是结缔组织如骨，软骨，肌肉，脂肪，韧带或腱。

在这些组织之一恶化的患者中，可以采用将HS8施用于恶化部位来刺激该部位的组织生长，增殖和/或分化。例如，刺激存在于或接近施用部位的间充质干细胞，优选地当FGF2也存在于该部位时，可能导致间充质干细胞增殖和分化成合适的结缔组织，从而提供用于损伤组织的替换/再生和损伤的治疗。

或者，可以收集从与HS8接触的间充质干细胞的体外培养获得的结缔组织，并将其植入损伤部位或疾病部位，以代替受损或恶化的组织。可以任选地先从损伤或疾病部位切除受损或恶化的组织。

另一方面，可以提供含有干细胞，优选间充质干细胞和HS8的药物组合物。在损伤、疾病或恶化部位的组合物施用，例如注射，可在该部位提供组织再生。

因此，HS8可用于体内伤口愈合，包括通过直接施用HS8，任选与FGF2和/或干细胞组合至需要治疗的病人而实现的组织修复，再生和/或替换(例如瘢痕组织或破骨的愈合)。HS8也可用于体外产生适于植入需要组织修复，再生和/或替换的患者中的组织。

如本文所示，HS8具有稳定FGF2的性质，从而延长其作用。HS8可以防止FGF2在培养基中降解(图46)。这可以有效地应用于FGF2制剂的储存和含有FGF2的培养基的制备。

因此，在本发明的一个方面，提供了包含生长因子和分离的HS8的组合物。生长因子可以是蛋白质生长因子，优选为FGF2。组合物可以包含分离的FGF2和分离的HS8。在一些实施方式中，组合物可以是培养基。在其它实施方式中，组合物可以是含有FGF2的药物组合物或药物。

组合物可以是在容器中包含FGF2和分离的HS8的FGF2制剂。合适的容器可以是瓶，小瓶，管或注射器。

还提供增加生长因子稳定性的方法，该方法包括使生长因子与分离的HS8接触。

生长因子的稳定性可以根据其半衰期来测量，即给定组合物中一半生长因子被降解和/或丧失活性所需的时间量。生长因子优选为蛋白生长因子，更优选为FGF2。HS8起到维持和延长FGF2半衰期的作用。该方法可以包括将分离的HS8体外接触生长因子(例如，FGF2)，例如作为生长因子(例如，FGF2)组合物制剂的一部分，其储存或运输。或者，该方法可以包括分离的HS8体内接触生长因子(例如，FGF2)，例如通过将分离的HS8施用于存在生长因子(例如FGF2[天然存在于组织中或外源加入至组织])的组织。该方法还可以包括添加外源性生长因子(例如，FGF2)至组织的步骤。

可以将含有分离的HS8(或其中已加入分离的HS8)的给定组合物或组织中的FGF2的稳定性与不含HS8可比较组合物(或其中未加入分离HS8的组合物)进行比较。在上述组合物和方法中，HS8可以如本文所述进行纯化。FGF2可以是分离和/或纯化的，非分离的或部分分离的，例如，细胞外基质材料的一部分，或存在于细胞组成中。分离或纯化的FGF2可以是重组FGF2。重组FGF2可从许多制造商商购获得，例如派普泰克(Peprotech)、默克密理博(Merck Millipore)、MA、生命科技公司、Gibco公司和英杰(Invitrogen)。

任选地，本发明的方面和实施方式不包括HS1或HS2(如Brickman等人(糖生物学\"Glycobiology”8卷5期第463-471页，1998年和WO2010/011185中描述)。在一些实施方式中，本发明的硫酸乙酰肝素不包括HS2，和/或具有图29所示亚硝酸二糖消化曲线的硫酸乙酰肝素，和/或具有图30所示亚硝酸二糖消化曲线的硫酸乙酰肝素。

以下编号的段落包含本文公开的本发明技术特征的广泛组合的陈述：

1.硫酸乙酰肝素HS8。

2.分离或基本纯化形式的硫酸乙酰肝素HS8。

3.根据段落1或2的硫酸乙酰肝素HS8，其中HS8能够结合具有氨基酸序列YCKNGGF(SEQ ID NO:2)或由其组成的肽或多肽。

4.根据段落3的硫酸乙酰肝素HS8，其中肽或多肽具有氨基酸序列GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO:1)或由其组成。

5.根据段落1至4中任一项的分离或基本上纯化的硫酸乙酰肝素HS8，其中随后用肝素裂解酶I、II和III消化，然后使所得二糖片段进行毛细管电泳分析，硫酸乙酰肝素HS8具有包含以下的二糖组成：

6.根据段落1至4中任一项的分离或基本上纯化的硫酸乙酰肝素HS8，其中随后用肝素裂解酶I、II和III消化，然后将所得二糖片段进行毛细管电泳分析，硫酸乙酰肝素HS8具有包含以下的二糖组成：

7.根据段落1至6中任一项的硫酸乙酰肝素HS8或分离或基本纯化形式的硫酸乙酰肝素HS8，其通过以下方法获得：

(i)提供一固体支持物，所述固体支持物具有粘附到该支持物上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列YCKNGGF的肝素结合结构域；

(ii)使多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触，使得允许形成多肽-糖胺聚糖复合物；

(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的其余部分分开；

(iv)从多肽-糖胺聚糖复合物中解离出糖胺聚糖；

(v)收集解离的糖胺聚糖。

8.段落7的方法，其中多肽具有选自GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列或由其组成。

9.段落7或8的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物是从猪肠粘膜获得的硫酸乙酰肝素制剂。

10.包含段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8的组合物。

11.段落10的组合物，还包含生长因子，优选FGF2。

12.包含段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8的药物组合物或药物。

13.段落12的药物组合物或药物，其中药物组合物或药物还包含FGF2蛋白和/或间充质干细胞。

14.段落12或13所述的药物组合物或药物用于医疗方法。

15.段落1-9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8用于医疗方法。

16.段落15所述的硫酸乙酰肝素HS8，其中医疗方法包括体内伤口愈合的方法。

17.段落15所述的硫酸乙酰肝素HS8，其中医疗方法包括组织，优选骨组织的修复和/或再生。

18.段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8在制备用于治疗疾病、病症或组织损伤的药物的用途，其中，所述方法涉及组织，优选骨组织的修复和/或再生。

19.一种治疗患者疾病、病症或组织损伤的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的硫酸乙酰肝素HS8，导致组织，优选骨组织修复和/或再生。

20.段落19的方法，其中所述方法包括将硫酸乙酰肝素HS8施用于伤口处或周围的组织或患者身体上需要再生或修复组织的位置。

21.段落19或20的方法，其中所述方法还包括向患者施用FGF2蛋白。

22.一种治疗患者疾病、病症或组织损伤的方法，所述方法包括在疾病、病症或损伤处或周围手术植入生物相容的植入物或假体至患者的组织，所述植入物或假体包含生物材料和段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8，导致组织的修复和/或再生。

23.一种生物相容性植入物或假体，其包含段落1至9中任一项所述的生物材料和硫酸乙酰肝素HS8。

24.一种形成生物相容性植入物或假体的方法，所述方法包括采用段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8涂覆或浸渍生物材料的步骤。

25.一种治疗患者骨折的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8。

26.段落25的方法，其中所述方法包括将所述硫酸乙酰肝素HS8施用于骨折周围的组织。

27.段落25的方法，其中施用所述硫酸乙酰肝素HS8包括将硫酸乙酰肝素注射到骨折周围的组织。

28.段落25至27中任一项的方法，其中所述硫酸乙酰肝素被配制成包含硫酸乙酰肝素和药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂的药物组合物或药物。

29.一种治疗患者骨折的方法，所述方法包括在骨折位置或周围手术植入生物相容的植入物或假体，所述植入物或假体包含生物材料和治疗有效量的段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8至患者的组织。

36.一种诸部分构成的试剂盒，该试剂盒包含预定量的段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8和预定量的FGF2。

37.含有治疗有效量的以下的产品：

(i)段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8；和以下之一或两者：

(ii)FGF2蛋白；

(iii)间充质干细胞，

同时，分开或顺序用于医疗方法。

38.一种增加生长因子，优选FGF2的稳定性的方法，所述方法包括将生长因子，优选FGF2与段落1至9中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS8接触。

具体实施方式

本发明人已经鉴定出一种新型的硫酸乙酰肝素分子，称为HS8。他们已经表明，HS8有以下优点：

·HS8富集表达STRO1的间充质干细胞(MSC)(图12，图14)；

·HS8导致STRO-1+ve亲和分离的MSC以及通过粘附到塑料上分离的MSC的增长(图17、18、19、20)。

·与缺乏HS8(HS8-ve级分)的硫酸乙酰肝素相比，HS8富集人MSC群体，其具有的表面标志物表达模式与人类MSC国际上公认的定义一致(图22)；

·使用HS8培养hMSC提供了具有高水平表达CD49a，SSEA-4和STRO-1的人MSC群体(图22)。相比之下，添加FGF-2作为hMSC的培养基补充剂负面影响表达STRO-1的hMSC的比例，并导致hMSC的多潜能丧失(图22、23和25)。

·HS8增加CFU-F形成；

·HS8增强FGF-2介导的MSC生长(图26)；

·HS8维持FGF2介导的ERK通路信号传导。

·HS8促进间充质干细胞的增殖(图42和43)

HS8

本发明涉及一类称为HS8的硫酸乙酰肝素分子。HS8分子可以通过富集含有一个或多个结合到对应于FGF2的肝素结合结构域的多肽的GAG的化合物的混合物的方法获得。特别地，HS8分子可以通过富集硫酸乙酰肝素而获得，所述硫酸乙酰肝素结合FGF2的肝素结合结构域，该结构域包含氨基酸序列YCKNGGF或由其组成。富集过程可用于分离HS8。

本发明还涉及富含HS8的化合物的混合物，以及使用这些混合物的方法。

除了可以通过本文所述的方法获得，HS8也可以在功能和结构上定义。

功能上，HS8能够结合具有氨基酸序列YCKNGGF(SEQ ID NO：2)或由其构成的肽。在肽的一端或两端肽可以含有一个或多个另外的氨基酸。举例来说，肽可以是GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO:1)。

优选地，HS8以小于100μM，更优选小于50μM，40μM，30μM，20μM或10μM的KD结合肽。

优选地，HS8还以小于100μM，更优选小于50μM，40μM，30μM，20μM或10μM的KD结合FGF2蛋白。HS8和FGF2蛋白之间的结合可以通过以下测定方法测定。

FGF2以3μg/ml的浓度溶解于封闭溶液(SAB中的0.2％明胶)，并建立封闭溶液中0-3μg/ml的稀释系列。将200μl FGF2各稀释液分配到肝素预包被的肝素/GAG结合板的三份孔中；在37℃下孵育2小时，用SAB小心洗涤三次，并在封闭溶液中加入200μl 250ng/ml生物素化的抗FGF2。在37℃孵育1小时，用SAB仔细洗涤3次，在封闭液中加入200μl 220ng/ml ExtrAvidin-AP，37℃孵育30分钟，用SAB仔细洗涤3次，轻扣除去残余液体，加入200μl显影试剂(SigmaFAST磷酸对硝基苯酯)。在室温下孵育40分钟，1小时内在405nm处读吸光度值。

在该测定中，结合可以通过测量吸光度来测定，并且可以相对于对照，例如在没有添加的硫酸乙酰肝素存在下的FGF2蛋白，或者加入不结合FGF2蛋白的硫酸乙酰肝素的FGF2蛋白来测定。

相比于非特异性结合，并且在HS8可以通过涉及选择显示与包含YCKNGGF如SEQ ID NO:1的肽或与FGF2蛋白高亲和结合相互作用的硫酸乙酰肝素的方法从其他硫酸乙酰肝素和/或GAG中选择的情况中，HS8的结合优选是特异性的。

本发明的HS8优选增进干细胞的增殖，同时保持其多能性或多潜能性。

用肝素裂解酶I，II和III消化完成后，然后将所得二糖片段进行毛细管电泳分析，HS8的二糖组成示于图44和45。

本发明的HS8包括硫酸乙酰肝素，具有归一化百分比值的±10％(更优选9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％)之内的二糖组分，各二糖示于图45(HS8保留物质)，或图44中(HS8保留物质)，如用肝素裂解酶I，II和III消化后将所得二糖片段进行毛细管电泳分析测定。

用肝素裂解酶I，II和III消化完后将所得二糖片段进行毛细管电泳分析测定的HS8的二糖组份具有以下任一所述的二糖组分：

或

或

或

或

或

在优选的实施方式中，列出的8种二糖的总重量百分比为100％(任选±3.0％或更小，或±2.0％或更小，±1.0％或更小，±0.5％或更小)。

HS8与对生长因子BMP2具有高亲和力分离的HS，称为HS3(WO2010/030244所述)比较显示，与HS3相比，HS8的结构不相似性的特征在于以下二糖的量：ΔUA-GlcNS,6S和ΔUA-GlcNS。特别地，相比于HS3，HS8具有更高的ΔUA-GlcNS,6S百分比组成，和更低的ΔUA-GlcNS百分比组成。

因此，HS8的特征在于具有ΔUA-GlcNS,6S百分比组成为15.5±4.0或更小、或±3.5或更小、或±3.0或更小、或±2.5或更小、或±2.0或更小、±1.5或更小、±1.0或更小、或±0.5或更小、或±0.25或更小、或±0.1或更小。HS8可以另外地或替代地具有15.7±4.0或更小、或±3.5或更小、或±3.0或更小、或±2.5或更小、或±2.0或更小、或±1.5或更小、或±1.0或更小、或±0.5或更小、或±0.25或更小，或±0.1或更小的ΔUA-GlcNS的百分比组成。

HS8的特征还在于具有12.7±1.5或更小，±1.0或更小，或±0.5或更小，或±0.25或更小、或±0.1或更小的ΔUA,2S-GlcNS,6S百分比组成。

HS8的特征还在于具有7.2或±2.0或更小，±1.5或更小，±1.0或更小，或±0.5或更小，或±0.25或更小、或±0.1或更小的ΔUA,2S-GlcNS百分比组成。

HS8的特征还在于具有6.5±1.5或更小，±1.0或更小，或±0.5或更小，或±0.25或更小，或±0.1或更小的ΔUA,2S-GlcNAc,6S的百分比组成。

HS8的特征还在于具有8.9±0.5或更小，或±0.25或更小，或±0.1或更小的ΔUA-GlcNAc,6S百分比组成。

在这些实施方式中，剩余的二糖组分的百分比组成可以如上所列，或如图44或45中所示±10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％。

采用肝素裂解酶I，II和III消化HS8和/或毛细管电泳分析二糖优选根据实施例18进行。

用肝素裂解酶消化HS制剂可以如下进行：各HS制剂(1mg)溶解在500μl乙酸钠缓冲液(100mM含有10mM乙酸钙，pH7.0)中，并且添加三种酶每种分别为2.5mU；37℃下将样品在温和倒转(9rpm)的样品管中孵育过夜(24小时)；向样品中再加入三种酶，每种2.5MU，37℃下在温和倒转(9rpm)的样品管中再孵育48小时；通过加热(100℃，5分钟)停止消化，然后冻干；将消化物重新悬浮于500μl水中，并取等分试样(50μl)进行分析。

可以如下进行来自HS制剂消化的二糖的毛细管电泳(CE)：毛细管电泳操作缓冲液是通过将20mM H3PO4水溶液加入到20mM Na2HPO4.12H2O的溶液中而得到，pH3.5；柱洗涤液是100mM NaOH(从50％w/w NaOH稀释)；使用装有0.2微米醋酸纤维素膜过滤器的过滤器单元过滤操作缓冲液和柱洗涤液；通过将二糖溶解在水(1mg/mL)中制备二糖Is(例如12)的储备溶液；标准品的校准曲线是通过制备包含含有10μg/100μl每种二糖的所有标准物的混合物，并制备含有10、5、2.5、2.25、0.625、0.3125μg/100μl的稀释系列测定；包括2.5μg内标(ΔUA,2S-GlcNCOEt,6S)。将HS消化物用水稀释(50μL/mL)，并向各样品添加相同的内标(2.5μg)。将溶液冷冻干燥并重新悬浮在水(1mL)中。使用PTFE亲水性一次性注射器过滤器单元过滤样品。

使用毛细管电泳仪在25℃于未涂布的熔融石英毛细管上进行分析，使用20mM的操作缓冲液，毛细管电压为30kV。在阴极(反极性)端使用流体动力学注入将样品引入毛细管。在每次运行之前，用100mM NaOH(2分钟)，用水(2分钟)冲洗毛细管并用操作缓冲液(5分钟)预处理。缓冲液补充系统取代入口和出口管中的缓冲液，以确保一致的体积，保持pH和离子强度。在样品序列的开始，中间和末尾，运行仅含水的空白。在232nm监测吸光度。所有数据都存储在数据库中，随后被取回和重新处理。可以进行一式两份或一式三份的消化/分析，并且将HS消化物中二糖的归一化百分比计算为分析结果的平均值。

在一些实施方式中，HS8具有在18至27kDa范围内的平均(平均的)分子量。在一些实施方式中，这可以是20至25kDa，21至25kDa，21至24kDa，21至23kDa，20至24kDa，20至23kDa或20至22kDa之一。

在一些实施方式中，HS8链包含至少25个二糖单元。在一些实施方式中，这可以是至少26个二糖，至少27个二糖，至少28个二糖，至少29个二糖，至少30个二糖，至少31个二糖，至少32个二糖，至少33个二糖34个二糖，至少35个二糖，至少36个二糖，至少37个二糖，至少38个二糖，至少39个二糖，至少40个二糖，至少41个二糖，至少42个二糖，至少43个二糖或至少44个二糖。

为鉴别HS8，发明人使用涉及富集表现出与具有肝素结合结构域的特定多肽结合的糖胺聚糖分子的方法。然后可以鉴定和测试分离的GAG混合物和/或分子调节表达含有肝素结合结构域的蛋白质的细胞和组织的生长和分化的能力。这使得能够在体外和体内对特定GAG糖序列对细胞和组织的生长和分化的影响进行受控分析。该方法在PCT/GB2009/000469(WO2010/030244)中描述，其通过引用并入本文。本发明人将这种方法应用于成纤维细胞生长因子2(FGF2)，以便分离和表征与FGF2具有高结合性的GAG。

因此，为了鉴别HS8，发明人提供了一种分离能够结合具有肝素/乙酰肝素结合结构域的蛋白质的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：

(i)提供一固体支持物，所述固体支持物具有粘附到该支持物的多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合结构域；

(ii)使多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触，使得允许形成多肽-糖胺聚糖复合物；

(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的其余部分分离；

(iv)从多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；

(v)收集解离的糖胺聚糖。

发明人还提供了通过调节细胞或组织的生长或分化的能力鉴定的分离的糖胺聚糖。为此，他们提供了鉴定能够刺激或抑制细胞和/或组织的生长和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括：

(i)提供一固体支持物，所述固体支持物具有粘附到该支持物的多肽分子，其中所述多肽包含肝素结合结构域；

(ii)使多肽分子与包含糖胺聚糖的混合物接触，使得允许形成多肽-糖胺聚糖复合物；

(iii)将多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的其余部分分离；

(iv)从多肽-糖胺聚糖复合物中解离糖胺聚糖；

(v)收集解离的糖胺聚糖；

(vi)将收集到的糖胺聚糖加入其中存在含有肝素结合结构域的氨基酸序列的蛋白质的细胞或组织；

(vii)测量细胞增殖、细胞分化，一种或多种蛋白质标记物的表达中的一种或多种。

本发明人使用这些方法鉴定能够结合FGF2的GAG(其称为HS8)，其中本发明人的方法中使用的多肽包含GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO：1)的肝素结合结构域。

在发明人的方法中，包含GAG的混合物可以含有合成的糖胺聚糖。然而，优选从细胞或组织获得的GAG。例如，混合物可以含有细胞外基质，其中细胞外基质材料是通过原位刮擦活体组织(即直接从其获得的人或动物的体内的组织)或通过刮擦从人体或动物体内提取的组织(活的或死的)获得。或者，细胞外基质材料可以从培养物中生长的细胞获得。细胞外基质材料可以从结缔组织或结缔组织细胞获得，例如，骨，软骨，肌肉，脂肪，韧带或肌腱。在一个实施方式中，使用市售的来自猪粘膜的硫酸乙酰肝素(Celsus HS)。

可以通过本领域技术人员熟知的一系列常规分离步骤(例如阴离子交换层析)从组织或细胞样品或提取物中提取GAG组分。

GAG混合物可以含有不同类型的糖胺聚糖的混合物，其可以包括葡聚糖硫酸盐，硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。与固体支持物接触的GAG混合物优选富含硫酸乙酰肝素。通过在GAG混合物上进行柱层析并选择合适的级分，可以获得富含硫酸乙酰肝素的GAG级分，如弱，中或强阴离子交换色谱，以及强高压液相色谱(SAX-HPLC)。

可以对所收集的GAG进行进一步分析，以便鉴定GAG，例如确定GAG组成或序列，或确定GAG的结构特征。GAG结构通常非常复杂，并且考虑到目前可用的分析技术，在大多数情况下，不可能精确测定GAG序列结构。

然而，收集的GAG分子可以进行部分或完全的糖消化(例如通过亚硝酸化学处理或用裂解酶如肝素酶III酶促)以产生既是GAG的特征性和诊断性的糖片段。特别地，可以使用消化产生二糖(或四糖)来测量获得的每种二糖的百分比，其将提供GAG的特征二糖\"指纹”。

也可以确定GAG的硫酸化模式并用于确定GAG结构。例如，对于硫酸乙酰肝素，氨基糖和C2，C3和C6位置处的硫酸化模式可用于表征硫酸乙酰肝素。

二糖分析，四糖分析和硫酸化分析可以与其他分析技术(如HPLC，质谱和NMR)结合使用，可以为GAG提供独特的光谱。结合起来，这些技术可以提供GAG的确定的结构表征。

例如，与Celsus HS(HS8自其衍生)和HS3(BMP2结合HS)相比，HS8的1H NMR谱如图31和32所示。本发明的HS8可以具有对应于图31或32的HS8光谱的1H NMR谱。在一些实施方式中，本发明的HS8可以具有如下1H NMR谱，其中4.0-3.5ppm的光谱对应于图32中HS8的光谱(3.8-3.7ppm之间上面的线)。在一些装饰中，本发明的HS8可以在约3.8ppm处具有峰值和/或在约3.7ppm处有峰值。在一些实施方式中，HS8可以通过例如，图32所示的其独特的次甲基和/或亚甲基1H NMR光谱与其它HS8区别。

GAG和肝素结合结构域之间的高亲和力结合相互作用表明GAG含有有助于高亲和力结合相互作用的特异性糖序列。另外的步骤可以包括测定参与结合相互作用的GAG的完整或部分糖序列或GAG的关键部分。

GAG-多肽复合物可以用裂解糖胺聚糖链的试剂，例如，裂解酶进行处理。裂解酶处理可以切割不参与和多肽结合相互作用的结合GAG的部分。参与和多肽结合相互作用的GAG的部分可以被保护免于裂解酶作用。除去裂解酶后，例如在洗涤步骤之后，保留与多肽结合的GAG分子代表多肽的特异性结合配偶体(\"GAG配体”)。由于较短的GAG分子的复杂性较低，在解离和收集GAG配体后，可以预期GAG配体的更高程度的结构表征。例如，任何糖序列(即GAG配体中包含的单糖的主要(线性)序列)，硫酸化模式，二糖和/或四糖消化分析，NMR光谱，质谱光谱和HPLC光谱的组合可以提供高水平的GAG配体结构表征。

如本文所用，术语\"富集的”，\"富集”，\"被富集”等描述了一种方法(或状态)，其中混合物的相对组成(或已经)被改变，使得其中由一个或多个这些实体给出的混合物的部分增加，而由一个或多个不同实体给出的混合物的部分降低。通过富集分离的GAG可以是纯的，即基本上仅含有一种类型的GAG，或者可以继续是不同类型的GAG的混合物，与起始混合物相比，该混合物具有更高比例的结合至肝素结合结构域的特定GAG。

当与表达或含有包含肝素结合结构域的蛋白质的细胞或组织接触时，所鉴定的GAG优选表现出功能效应。功能效应可能是调节或增强效应。功能效应可以是促进(刺激)或抑制某种类型的细胞的增殖或一种细胞类型分化成另一种细胞，或一种或多种蛋白质标记物的表达。例如，GAG可以促进细胞增殖，即增加细胞数量，或促进干细胞分化为特殊细胞类型(例如结缔组织中的间充质干细胞)，促进或抑制指示多能性的蛋白质标记物的表达或细胞的分化状态(例如，标记物如碱性磷酸酶活性，检测RUNX2，osterix，胶原I，II，IV，VII，X，骨桥蛋白，骨钙素，BSPII，SOX9，聚集蛋白聚糖，ALBP，CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)，脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)，碱性磷酸酶(ALP)，骨涎蛋白2(BSPII)，胶原蛋白2a1(Coll2a)和SOX9)。

如本文所使用的，术语\"调节效应”被理解为意味着第一实体对第二实体的影响，其中在另一过程或多个过程中第二实体的正常功能被第一实体的存在修改。调节作用可能是激动的或拮抗的。

调节效应可能是增效作用。术语\"增效作用”被理解为意味着增加效力的效果。在本发明的优选实施方式中，术语\"增效作用”是指第一实体对第二实体上具有的效果，该效应增加了另一过程或过程中该第二实体的效力。在本发明的另一个优选实施方式中，增效作用被理解为是指分离的GAG对肝素结合因子的作用，其中所述作用增加所述肝素结合因子的效力。

如本文所使用的，\"接触”的过程涉及使两个或多个离散实体物理接近。\"接触”的过程涉及使两个或多个离散实体紧密接近一段时间，并且在足以允许这两个或更多个离散实体的部分在分子水平上相互作用的条件下。优选地，如本文所用，\"接触”的方法包括使具有一种或多种GAG的化合物和对应于肝素结合因子的肝素结合结构域的多肽的混合物接近。\"接触”方法的实例包括混合，溶解，溶胀，洗涤。在优选实施方式中，GAG混合物和多肽的\"接触”对于在彼此表现出高亲和力的GAG和多肽之间形成复合物是足够的，所述复合物可以共价但优选是非共价的。

多肽可以包含具有肝素结合结构域的所选蛋白质的全长或近全长的一级氨基酸序列。由于可能发生在更长的多肽中的折叠，导致可能从GAG混合物掩蔽肝素结合结构域，所以多肽优选是短的。优选地，多肽将具有包括肝素结合结构域的氨基酸序列，并且任选地在肽的一个或各个N-或C-末端包括一个或多个氨基酸。这些另外的氨基酸可以使得将多肽连接到固体支持物所需的多肽上可以添加接头或连接分子。

在发明人的方法的优选实施方式中，除了肝素结合结构域中的氨基酸数目外，多肽含有1-20，更优选1-10，还更优选1-5个另外的氨基酸。在一些实施方式中，肝素结合结构域的氨基酸序列占多肽的氨基酸的至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％。为了将多肽连接到固体支持物的表面，优选将多肽修饰为包括分子标签，并且修饰固体支持物的表面以引入对分子标签具有高亲和力的相应分子探针，即分子标签和探针形成一个结合对。标签和/或探针可以选自以下任何一种：抗体，细胞受体，配体，生物素，这些结构的任何片段或衍生物，前述的任何组合，或者探针可以与其结合的任何其它结构被设计或配置为结合或以其他方式与特异性相关联。适合用作标签和探针的优选结合对是生物素和抗生物素蛋白。

多肽衍生自感兴趣的蛋白质，其在目前的情况下是FGF2。\"衍生自”是指挑选，选择或制备多肽，因为其含有存在于感兴趣的蛋白质中的肝素结合结构域的氨基酸序列。肝素结合结构域的氨基酸序列可以从感兴趣的蛋白质中出现的氨基酸序列修饰，如，从而考察肝素结合域序列变化对GAG结合的影响。

在本说明书中，蛋白质是FGF2。优选的肝素结合结构域的氨基酸序列是GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQ ID NO：1)[在人FGF2的氨基酸157-172发现]，或具有序列YCKNGGF(SEQ ID NO：2)的序列。

本领域技术人员应当理解，特定多肽的氨基酸序列的小变化可允许维持该部分的固有功能。还应当理解，用具有等排的和/或等电子的其它氨基酸残基取代肽内的某些氨基酸残基可以维持或改善未取代肽的某些性质。这些变化也包括在本发明的范围内。例如，氨基酸丙氨酸有时可以替代氨基酸甘氨酸(反之亦然)，同时保持肽的一种或多种性质。\"等排的”一词是指两个实体之间的空间相似性。在适度升高的温度下是等排的部分的两个实例是异丙基和叔丁基。术语\"等电子的”是指两个实体之间的电子相似性，例如两个实体具有相同或相似的功能，pKa的情况。

对应于肝素结合结构域的多肽可以是合成的或重组的。

固体支持物可以是具有可以通过共价键或非共价键直接或间接连接分子的表面的任何基底。固体支持物可以包括能够为连接到表面的探针提供物理支持的任何基底材料。它可能是一个基质支持物。该材料通常能够承受与将探针连接到表面以及在测定过程中遇到的任何随后的处治，操作或处理相关的条件。材料可以是天然存在的，合成的或天然存在的材料的修饰物。固体支持物可以是塑料材料(包括聚合物，例如聚氯乙烯，环烯烃共聚物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲基丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚四氟乙烯(PTFE或)，尼龙，聚乙烯丁酸酯))等，其自身或与其它材料一起使用。可以考虑额外的刚性材料，例如玻璃，其包括二氧化硅，并且还包括例如可用作生物玻璃的玻璃。可以使用的其它材料包括多孔材料，例如受控孔隙玻璃珠。也可以考虑本领域已知的能够具有一个或多个官能团的任何其它材料，例如结合在其表面上的氨基，羧基，硫醇或羟基官能团中的任何一种。

优选的固体支持物包括固定在柱表面上的多肽。表面可以是柱的壁，和/或可以由填充到柱的中心空间中的珠提供。

多肽可以固定在固体支持物上。固定方法的实例包括：吸附，共价结合，捕获和膜限制。在本发明的优选实施方式中，多肽和基质之间的相互作用基本上是永久性的。在本发明的另一个优选实施方式中，肽和基质之间的相互作用对于离子交换层析是适当惰性的。在优选的布置中，多肽连接到固体支持物的表面。应当理解，本领域技术人员将具有选择从化学和/或物理上将两个实体彼此连接的大量选项。这些选项都包括在本发明的范围内。在优选的布置中，多肽通过生物素与链霉亲和素的相互作用吸附到固体支持物上。在该布置的代表性实例中，生物素分子与多肽共价键合，于是生物素-多肽缀合物结合至链霉亲和素，其又已经共价键合到固体支持物上。在另一种布置中，可以使用间隔基或连接体部分连接生物素分子与多肽，和/或链霉亲和素与基质。

通过使GAG混合物与固体支持物接触GAG-多肽复合物形成。通过从固体支持物除去剩余的混合物，将其与混合物的其余部分分离，例如，通过洗涤固体支持物从而洗脱未结合的物质。当柱用作固体支持物时，GAG混合物的非结合组分可以从柱洗脱，留下结合到柱的GAG-多肽复合物。

应当理解，某些寡糖可以以非特异性方式与多肽相互作用。在某些实施方式中，以非特异性方式与多肽相互作用的寡糖可以包含在富含一种或多种调节肝素结合因子作用的GAG的化合物的混合物中或从其中排除。非特异性相互作用的例子是适当尺寸和/或成形分子的口袋内的临时约束。此外，应当理解，这些寡糖可以比根本不显示与肽相互作用的那些寡糖洗脱更慢。此外，应当理解，非特异性结合的化合物可能不需要输入相同的外部刺激以使其与特定方式(例如通过离子相互作用)结合的那些化合物一起洗脱。本发明人的方法学能够将寡糖的混合物分离成该混合物的那些组分：以特定方式结合多肽(的那些)；以非特异性方式结合多肽的那些；和不结合多肽的那些。对于每个GAG-肽对，这些指定是可操作地定义的。

通过改变存在于发生GAG与多肽结合的固体支持物表面的条件(例如盐浓度)，可以选择对肝素结合结构域具有最高亲和力和/或特异性的那些GAG。因此可以获得对目标蛋白质和/或目标蛋白质的肝素结合结构域具有高结合亲和力的GAG。结合亲和力(Kd)可以选自小于10μM，小于1μM，小于100nM，小于10nM，小于1nM，小于100pM之一。

通过所述方法获得的GAG在体外和/或体内的一系列应用中有用。可以在体外培养细胞或组织，或体内细胞或组织中提供GAG用于刺激或抑制细胞或组织生长和/或增殖和/或分化。

可以提供GAG作为用于此目的的制剂。例如，可以提供包含通过所述方法获得的GAG的培养基，即包含HS8。

在HS8存在下从体外细胞或组织培养获得的细胞或组织可以被收集并植入需要治疗的人或动物患者中。因此可以提供植入细胞和/或组织的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在体外培养与HS8接触的细胞和/或组织；

(b)收集细胞和/或组织；

(c)将细胞和/或组织植入需要治疗的人或动物受试者。

可以在步骤(a)中与HS8接触细胞一段足以允许细胞或组织生长，增殖或分化的时间。例如，该时间段可以选自：至少5天，至少10天，至少20天，至少30天或至少40天。

在另一个实施方式中，HS8可以配制用于医疗方法，包括预防或治疗损伤或疾病。可以提供包含HS8和药学上可接受的稀释剂，载体或佐剂的药物组合物或药物。可以提供这样的药物组合物或药物用于预防或治疗损伤或疾病。还提供了HS8在制备用于预防或治疗损伤或疾病的药物中的用途。任选地，根据本发明的药物组合物和药物还可以含有目的蛋白质(即，FGF2)，其具有GAG结合的肝素结合结构域。在另外的实施方式中，药物组合物和药物可以进一步包含干细胞，例如，间充质干细胞。

损伤或疾病的治疗可能包括细胞或组织，如结缔组织(如骨，软骨，肌肉，脂肪，腱或韧带)的修复，再生或置换。对于组织修复，包含HS8的药物组合物或药物可以直接施用于损伤或疾病的部位，以刺激新组织的生长，增殖和/或分化，以实现损伤的修复或治愈或减轻疾病状况(例如缓解症状)。通过将干细胞组合在药物组合物或药物中可以改善组织的修复或再生。

对于置换组织，在体外培养细胞和/或组织期间，HS8可以与细胞和/或组织接触，以便在患者的损伤或疾病部位产生用于植入的细胞和/或组织。细胞或组织的植入可用于通过置换受损组织或患病组织来修复患者的受损组织或患病组织。这可能涉及切除损伤/患病组织和植入通过与HS8接触培养的细胞和/或组织制备的新组织。

因此，本发明的药物组合物和药物可以包含以下之一：

(a)HS8；

(b)HS8与干细胞的组合；

(c)HS8与蛋白质的组合，该蛋白质包含HS8结合的肝素结合结构域(例如，SEQ ID NO：1)；

(d)HS8与干细胞和蛋白质的组合，该蛋白质包含HS8结合的肝素结合结构域(例如，SEQ ID NO：1)；

(e)从与HS8接触培养的细胞或组织获得的组织或细胞。

HS8可用于身体组织的修复或再生，特别是骨再生，神经再生，骨骼组织构建，心血管损伤的修复以及胚胎和成体干细胞的扩增和自我更新。因此，HS8可以用于预防或治疗各种疾病和损伤，包括骨关节炎，软骨置换，任何类型的骨折(例如脊椎椎间盘融合治疗，长骨断裂，颅骨缺损)，临界或非联合骨缺陷再生。

HS8在组织修复，再生或置换中的应用可能涉及伤口愈合中的应用，如伤口愈合加速，瘢痕或骨组织愈合及组织移植。

另一方面，本发明提供一种包含HS8的生物支架。在一些实施方式中，本发明的生物支架可用于矫形，血管，假体，皮肤和角膜应用。由本发明提供的生物支架包括延长释放药物递送装置，组织瓣膜，组织瓣膜小叶，药物洗脱支架，血管移植物，伤口愈合或皮肤移植物以及诸如骨，韧带，腱，软骨和肌肉的矫形假体。在本发明的一个优选实施方式中，生物支架是导管，其中内部(和/或外部)表面包含一个或多个连接到导管的GAG化合物(包括HS8)。

另一方面，本发明提供了一种或多种通过所述方法分离的GAG(包括HS8)用作佐剂。佐剂可以是免疫佐剂。

在另一方面，本发明提供药学上可接受的制剂，其包括包含一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集HS8。在另一方面，本发明提供药学上可接受的制剂，其包含：

(i)包含一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集HS8；和

(ii)FGF2，

用于单独，同时或顺序给药。在优选的实施方式中，制剂包括包含一种或多种GAG的化合物的混合物，所述混合物富集密切混合的HS8和FGF2，并且同时施用于需要治疗的患者。

在本发明的另一方面，提供用于组织修复或再生的试剂盒，所述试剂盒包含(i)预定量的HS8；和(ii)预定量的FGF2。

本发明化合物的富集混合物可以作为其药学上可接受的盐给予受试者。例如，本发明化合物的碱式盐的富集混合物包括但不限于与药学上可接受的阳离子形成的盐，例如钠，钾，锂，钙，镁，铵和烷基铵。本发明在其范围内包括阳离子盐，例如钠盐或钾盐。应当理解，本发明含羧酸基团的化合物的混合物可以以可施用的前药的形式递送，其中酸部分被酯化(从而具有–CO2R\\\'形式)。术语\"前药”具体涉及体内将-OR\\\'基团转化为-OH基团或羧酸根阴离子。因此，本发明的前药可以用于增强药物吸附和/或药物递送到细胞中。前体药物的体内转化可以通过细胞酶如脂肪酶和酯酶或通过化学裂解如体内酯水解来促进。根据本发明方面的药物和药物组合物可以配制成通过多种途径施用，包括但不限于，在疾病或损伤部位注射。药物和组合物可以配制成流体或固体形式。可以将流体制剂配制成通过注射给人或动物体的选定区域来施用。

给药优选为以\"治疗有效量”，这足以显示对个体的益处。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗的损伤或疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如关于剂量的决定等等，在全科医生和其他医生的责任之内，通常考虑待治疗的疾病，个体患者的状况，递送位置，给药方式以及从业者已知的其他因素。

上述技术和方案的实例可以在《雷明顿药物科学》，20版，2000出版，利平科特，威廉姆斯和威尔金斯(Remington\\\'s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub。Lippincott，Williams Wilkins)中找到。

干细胞

与HS8接触的细胞包括干细胞。

HS8可用于干细胞的增殖和/或分化，和/或干细胞的谱系定型。

本文培养和描述的干细胞可以是任何种类的干细胞。它们可以是全能的或多能的(多能性的)。它们可以是来自任何组织的胚胎或成体干细胞，并且可以是造血干细胞，神经干细胞或间充质干细胞。优选它们是成体干细胞。

在本说明书中，干细胞是指具有分裂能力(即自我更新)并保持全能或多能(多能性)并产生特化细胞的任何细胞类型。

本发明中培养的干细胞可以从现有的培养物或直接从任何成体，胚胎或胎儿组织获得或衍生，包括血液，骨髓，皮肤，上皮细胞或脐带(通常被丢弃的组织)。

干细胞的多能性可以通过使用合适的试验来确定。这种试验可以包括检测一个或多个多能性标记，例如碱性磷酸酶活性，检测RUNX2，成骨相关转录因子(osterix)，胶原I，II，IV，VII，X，骨桥蛋白，骨钙素，BSPII，SOX9，聚集蛋白聚糖，ALBP，CCAAT/增强子结合蛋白质-α(C/EBPα)，脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)，碱性磷酸酶(ALP)，骨唾液酸糖蛋白2(BSPII)，胶原蛋白2a1(Coll2a)和SOX9。

在一些优选的实施方式中，干细胞是例如，能够分化成结缔组织和/或骨细胞如软骨细胞，成骨细胞，肌细胞和脂肪细胞的间充质干细胞(MSC)。

间充质干细胞通过微创技术容易从骨髓获得，并且可以在培养物中扩增并允许分化成所需的谱系。分化可以通过应用特定的生长因子诱导。转化生长因子β(TGF-β)超家族成员蛋白如骨形态发生蛋白(BMP)是间充质干细胞的软骨形成和成骨分化的重要因子。

可以使用选择性标记物，例如STRO-1，从CD34+级分分离并检测间充质干细胞，表明它们具有骨髓再生潜力。这些细胞表面标志物仅在间充质干细胞的细胞表面上发现，并且是细胞多能性的指示物。

合适的间充质干细胞可以获自或衍生自从骨髓抽吸物(例如，Wexler等.成人骨髓是人类间充质\"干细胞”的丰富来源，但脐带和动员的成人血液不是\"Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal\\\'stem\\\'cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not”.造血作用和白细胞英国血液学杂质\"HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Hematology”121(2)：368-374，2003年4月)或脐带华氏胶组织\"Wharton’s Jelly”(例如Ta等.华氏胶组织来源的间充质干细胞的长期扩增和多能标记阵列分析\"Long-term Expansion and Pluripotent Marker Array Analysis of Wharton’s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells”.干细胞发展\"Stem Cells Dev.”2009年7月20(E出版))收集的骨髓单核细胞(BMMNC)。

通过应用合适的分化因子，可以通过分化多能干细胞(例如人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞)获得间充质干细胞，如本领域公知的。

间充质干细胞是多能(多能性)祖细胞，具有产生软骨，骨骼，肌肉，肌腱，韧带和脂肪成分的能力。这些原始祖细胞产后存在，表现出干细胞特征，即低发病率和广泛的更新潜力。这些性质与其发育可塑性相结合，对其替代受损组织的潜在用途产生了极大的兴趣。实质上，这些干细胞可以被培养以扩大其数量，然后移植到受伤部位，或者在支架内/上接种后以产生适当的组织构建体。

因此，用于骨骼肌，肌肉，肌腱，韧带和血液修复/再生的替代方法是选择、扩增和调整合适的祖细胞，如在骨的情况下是骨祖细胞(例如间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、骨干细胞或骨前体细胞)，与导电性或感应性支架结合以支持和引导再生以及明确选择特定组织生长因子。

干细胞可以从任何动物或人获得，例如，非人类动物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括来自啮齿目的任何动物的细胞)、猫、狗、猪、羊、山羊、牛、马、非人灵长类动物或其他非人类脊椎动物；和/或非人哺乳动物；和/或人类。优选它们是人。任选地，它们是非人的。任选地，它们是非胚胎干细胞。任选地，它们不是全能的。

在本发明的另一方面，提供了包含通过本发明的任何方法产生的干细胞或其它细胞或其片段或产物的药物组合物。药物组合物可用于医疗方法。合适的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂。

在本发明的另一方面，通过本发明任何方法产生的干细胞或其它细胞可以用于医疗方法中，优选地，提供一种医疗方法，包括向需要治疗的个体施用治疗有效量的所述药物或药物组合物。

通过本发明的培养方法和技术获得的干细胞和其它细胞可用于分化成用于医疗方法的另一细胞类型。因此，分化细胞类型可以衍生自通过所述培养方法和技术获得并且随后能分化的干细胞并认为是其产物。可以提供包含这种分化细胞，和任选含药学上可接受的载体，佐剂或稀释剂的药物组合物。这样的药物组合物可用于医疗方法。

间充质干细胞

间充质干细胞(MSC)最初从骨髓中分离出来，在104-105个总骨髓单核细胞(BMMNC)中仅存在一个(Friedenstein等，1966)。这些细胞能够产生衍生自单细胞前体的集落，称为CFU-F(集落形成单位成纤维细胞)种群。现在已经在包括脂肪组织在内的许多其他组织(Gimble和Guilak 2003；Zuk等，2001)，脐带血(Bieback等，2004；Erices等，2000；Goodwin等，2001；Kogler等，2004；Wagner等，2005)和肌肉(Jiang等，2002)中被鉴别。

多潜能人间充质基质细胞(MSC)的最低标准已由国际细胞治疗协会(Dominici等，细胞疗法\"Cytotherapy”(2006)卷8，第4期，315-317)阐述。他们提出三个标准来定义人MSC：贴壁至塑料，比表面抗原表达和多能分化潜能。特别地，他们陈述：\"首先，当在使用组织培养瓶保持在标准培养条件下时，MSC必须是贴附塑料。第二，通过流式细胞仪测量，≥95％的MSC群体必须表达CD105，CD73和CD90。此外，这些细胞必须缺乏CD45，CD34，CD14或CD1bb，CD79α或CD19和HLA II类(HLA-DR)的表达(≤2％阳性)。第三，在体外标准分化条件下，细胞必须能够分化成成骨细胞，脂肪细胞和成软骨细胞。”

Dominici等人还指出，使用体外标准组织培养分化条件，最独特地鉴定MSC的生物学特性是它们分化为成骨细胞，脂肪细胞和成软骨细胞的三系间充质分化的能力。他们证实，通过用茜素红或冯·科萨染色可以证明分化成骨细胞，脂肪细胞分化最容易通过油红O染色证实，且成软骨细胞分化可以通过用阿尔新蓝染色或免疫组织化学染色II型胶原来证明。Dominici等人说，用于这种测定的试剂盒是商业上可获得的，并且显示分化对所有研究者应该是可行的。

Dominici等人也认识到，将来可能会识别出新的表面标记，也可用于界定人类MSC。现在已知有三种这样的标记：CD49a，SSEA-4和STRO-1。

Rider等报道，与未分选细胞相比，CD49a+克隆具有增强的CD90和CD105表达，并且证明与未分选细胞相比，CD49a+克隆容易进行多向分化为脂肪，骨和软骨，支持使用α-1整合素(CD49a)选择以富集间充质干细胞，并提供了从异质性骨髓单核干细胞池中选择最多的多能细胞的策略(Rider等.J.Mol.Hist(2007)38：449-458)。Rider等人也报道说，CFU-F细胞与CD49a的表达有关，表达CD49a的CFU-F细胞也共表达STRO-1，CD49a可用于除人之外从大鼠和小鼠分离MSC，表明它可能是保守的富集标记。

Gang等人报道，通常用作未分化多能人胚胎干细胞和胚泡期胚胎卵裂的阶段特异性胚胎抗原SSEA-4也鉴定成年人间充质干细胞群体，并可用于分离MSC(Gang等，血液\"Blood”，2007；109：1743-1751)。Gang等人还描述了在克隆形成基质细胞(CFU-F)的富集中使用结合表面标志物STRO-1的单克隆抗体-所谓的STRO-1+亮(STRO-1+bright)。

糖胺聚糖

如本文所用，术语\"糖胺聚糖”和\"GAG”可互换使用，并且被理解为是指包含寡糖的分子大集合，其中一种或多种这些结合的糖类具有氨基取代基，或其衍生物。GAG的实例是硫酸软骨素，硫酸角质素，肝素，硫酸皮肤素，透明质酸和硫酸乙酰肝素。

如本文所用，术语\"GAG”还延伸到包括是GAG缀合物的那些分子。GAG缀合物的实例是蛋白糖胺聚糖(PGAG，蛋白聚糖)，其中肽组分共价连接至寡糖成分。

硫酸乙酰肝素(HS)

硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)代表蛋白聚糖高度多样化亚组，并且由共价连接到蛋白质主链上的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖侧链组成。核心蛋白以三种主要形式存在：称为串珠素(perlecan)的分泌形式，锚定在质膜中的形式称为磷脂酰肌醇聚糖，以及称为共结合聚糖(syndecan)的跨膜形式。它们是哺乳动物细胞表面和大多数细胞外基质的普遍存在的成分。存在其它蛋白质，例如集聚蛋白或淀粉样前蛋白，其中HS链可以连接到较不常见的核心。

最初在高尔基体中合成\"硫酸乙酰肝素”(\"硫酸乙酰肝素”或\"HS”)，作为由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)串联重复组成的多糖。新生的多糖可以在一系列步骤中进行后续修饰：GlcNAc的N-脱乙酰化/N-硫酸化，GlcA的C5异构化为艾杜糖醛酸(IdoA)，在IdoA和GlcA的C2的O-硫酸化，在N-磺基葡糖胺(GlcNS)的C6的O-硫酸化和在GlcNS的C3处偶尔的O-硫酸化。HS的N-脱乙酰化/N-硫酸化，2-O-，6-O-和3-O-硫酸化分别由HS N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶(HSNDST)，HS 2-O-磺基转移酶(HS2ST)，HS 6-O-磺基转移酶(HS6ST)和HS 3-O-磺基转移酶的特异作用介导。在各修饰步骤，只有一部分潜在的底物被修饰，导致相当大的序列多样性。HS的这种结构复杂性使得难以确定其序列并了解HS结构和功能之间的关系。

硫酸乙酰肝素侧链由交替排列的D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸和D-葡糖胺组成，通过(1→4)糖苷键连接。葡糖胺通常是N-乙酰化或N-硫酸化的，并且糖醛酸和葡糖胺都可以另外被O-硫酸化。特定HSPG对特定结合配偶体的特异性是通过连接到葡糖胺和糖醛酸的羧基，乙酰基和硫酸基团的特定模式产生。与肝素相反，硫酸乙酰肝素含有较少的N-和O-硫酸基团和更多的N-乙酰基。硫酸乙酰肝素侧链通过四糖键(-葡糖醛酸-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→3)-半乳糖基-β-(1→4)-木糖基-β-1-O-(丝氨酸))连接到核心蛋白的丝氨酸残基区域。

硫酸乙酰肝素链和核心蛋白都可能经历可能最终影响其生物活性的一系列修饰。HS的复杂性被认为超过核酸(Lindahl等,1998,J.Biol.Chem.273,24979；Sugahara和Kitagawa,2000,Curr.Opin.Struct.Biol.10,518)。HS物质的变异源于由非随机高度硫酸化的糖残基的合成，其由含有N-乙酰化葡糖胺的二糖的非硫酸化区域分离。N-乙酰葡糖胺向N-磺基葡糖胺的初始转化为其他修饰创建焦点，包括葡萄糖醛酸差向异构化为艾杜糖醛酸以及在葡糖胺或艾杜糖醛酸上O-硫酸化的复杂形式。此外，在未修饰的低硫酸化N-乙酰化序列中，己糖酸残基保留为葡萄糖醛酸酯，而在高度硫酸化的N-硫酸化区域中，C-5差向异构体衍生物占优势。这限制了任何给定链中可能的潜在二糖变体的数量，但不限于每种变体的丰度。大多数修饰发生在N-硫酸化结构域中，或直接与它们相邻，使得在成熟链中存在由低硫酸化结构域分离的高硫酸化区域(Brickman等，(1998),J.Biol.Chem.273(8),4350-4359,其全部内容通过引用并入本文)。

假设高度可变的硫酸乙酰肝素链在调节大量细胞外配体的作用中起关键作用，包括通过自分泌，近分泌和旁分泌反馈回路的复杂组合对细胞的生长和粘附因子的调节和呈递，从而控制细胞内信号传导，从而控制干细胞的分化。例如，即使肝素乙酰硫酸糖胺聚糖可能从遗传学角度描述(Alberts等(1989)加兰(Garland)出版公司，纽约和伦敦，第804和805页)，从单一来源分离的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖物种可能在生物活性上不同。如Brickman等，1998，糖生物学\"Glycobiology”8,463所述，从神经上皮细胞获得的两个分离的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖库可以根据促有丝分裂状态特异性地激活FGF-1或FGF-2。类似地，在WO 96/23003中描述了硫酸乙酰肝素(HS)与FGF-1或FGF-2相互作用的能力。根据该专利申请，能够与FGF-1相互作用的各自的HS可从约11至约13的胚胎期的鼠细胞获得，而能够与FGF-2相互作用的HS可在胚胎期约8天到约10天获得。

如上所述，HS结构是高度复杂的并在HS之间可变。实际上，HS结构的变化被认为是促进每个HS在促进细胞生长和引导细胞分化中的不同活性的重要部分。结构复杂性被认为超过了核酸的结构复杂性，尽管HS结构可能被表征为具有特异性和独特的硫酸化模式的重复二糖单元的序列，但目前没有与核酸测序可用的那些相当的标准测序技术可用于确定HS序列结构。在没有用于确定明确的HS序列结构的简单方法的情况下，本领域的技术工作者通过许多分析技术积极地鉴定和结构表征HS分子。这些包括二糖分析，四糖分析，HPLC和分子量测定中的一种或组合。这些分析技术是本领域技术人员所熟知并使用的。

从HS生产二糖和四糖的两种技术包括亚硝酸消化和裂解酶消化。下面仅以举例的方式提供进行这些消化技术的一种方法的描述，这样的描述不限制本发明的范围。

亚硝酸消化

硫酸乙酰肝素的基于亚硝酸的解聚导致当完成时碳水化合物链最终降解成其各自的二糖成分。

例如，可以分别通过在冰上冷却250μl的0.5M H2SO4和0.5M Ba(NO2)2 15分钟来制备亚硝酸。冷却后，将Ba(NO2)2与H2SO4混合并涡旋，然后离心除去硫酸钡沉淀。将125μl的HNO2加入到重悬于20μl水中的GAG样品中，涡旋后在25℃下孵育15分钟，并偶尔混合。孵育后，将1M Na2CO3加入到样品中使其达到pH6。接下来，向样品中加入0.1M NaOH中的100μl 0.25M NaBH4，将混合物加热至50℃20分钟。然后将混合物冷却至25℃，加入酸化的冰醋酸使样品达到pH3。然后将混合物用10M NaOH中和，并通过冷冻干燥降低体积。最终样品在Bio-Gel P-2柱上过柱以分离二-和四糖来验证降解程度。

裂解酶消化

肝素酶III在葡萄糖醛酸键处裂解糖链。一系列肝素酶(I，II和III)通过在特定的硫酸化识别位点解聚某些硫酸乙酰肝素序列而各自显示相对特定的活性。肝素酶I沿HS链切割具有NS区域的HS链。这导致硫酸化区域的破坏。肝素酶III解聚具有NA结构域的HS，导致碳水化合物链分离为单独的硫酸化结构域。肝素酶II主要在HS链的NA/NS\"肩”结构域中切割，其中发现变化硫酸化模式。注意：乙酰肝素聚合物的重复二糖骨架是与氨基糖葡糖胺连接的糖醛酸。\"NS”是指氨基糖在氨基上携带硫酸根，可使其它基团在C2，C6和C3上硫酸化。\"NA”表示氨基未被硫酸化并保持乙酰化。

例如，对于使用肝素酶III在NA区域中的解聚，酶和冻干的HS样品在pH7.5含有20mM Tris-HCl，0.1mg/ml BSA和4mM CaCl2的缓冲液中制备。纯粹举例来说，肝素酶III可以以5mU/1μg HS的量加入，并在37℃温育16小时，然后加热至70℃5分钟停止反应。

二糖和四糖可以通过柱色谱法洗脱。

在皮肤修复和/或再生中使用HS8

我们已经开发出纯化的HS制剂，本文所述的HS8，其更特异地靶向FGF-2。我们已经表明它具有增加的对FGF-2的亲和力，增加了人皮肤成纤维细胞的生长速度，并引发角质形成细胞和真皮成纤维细胞的划痕伤口测定反应。HS8将作为诱导创伤，烧伤，溃疡或疾病后皮肤的修复的佐剂进行试验。HS8将作为能稳定并减少治疗皮肤慢性伤口，包括全部厚度，切除伤口所需的生长因子的量的佐剂进行试验。因此，HS8提供了治疗非愈合性皮肤伤口(例如糖尿病性溃疡)的有用的治疗工具，其是卫生系统中主要和越来越多的消耗，且是紧急和主要未满足的临床需求。

因此，本发明的方面涉及HS8在皮肤的修复和/或再生中的治疗用途。可能需要修复或再生皮肤，以应对皮肤伤口损伤或形成。治疗用途可能涉及治疗任何种类的皮肤伤口或皮肤瘢痕。伤口可能是急性或慢性的。伤口可能是缓慢愈合或不愈合的。

损伤可能是任何破坏皮肤屏障的损伤。在一些实施方式中，损伤可能是物理或机械损伤。它可能是切除伤口或切除皮肤创伤。在一些实施方式中，伤口可以是切割，刺伤或穿刺伤口。在一些实施方式中，其可以是手术切口。在其它实施方式中，损伤可能是烧伤的结果，其可能是热或化学烧伤。可能被治疗的烧伤可能是第一度，第二度或第三度。HS8的作用可能是为了促进或加速伤口愈合过程，以应对这种损伤。

在一些实施方式中，HS8可用于促进或加速皮肤伤口愈合或皮肤移植物愈合，例如，皮肤移植后，皮肤重建或皮肤整形手术。在一些实施方式中，HS可以用于减少或最小化皮肤伤口愈合期间的瘢痕形成。在一些实施方式中，HS8用于在皮肤中实现无疤痕的伤口愈合。

HS8在皮肤伤口愈合中的治疗应用包括整形手术、结肠直肠吻合手术、缝合缝线后的伤口愈合、治疗烧伤、血管/动脉/压力性溃疡治疗、皮肤切口/创伤伤口修复、激励血管回到表皮区和刺激表皮干细胞功能。

在一些实施方式中，HS8可用于治疗皮肤溃疡，例如糖尿病性皮肤溃疡。皮肤溃疡可能是非愈合性溃疡，例如非愈合下肢溃疡。

在一些任选的实施方式中，HS8不用于皮肤的移植物抗宿主病的治疗。

皮肤移植，重建和整形手术

皮肤移植涉及皮片移植，并且通常用于治疗创伤性伤口，其中大面积皮肤损伤，例如，在烧伤，皮肤癌或继发感染如坏死性筋膜炎。

该方法通常涉及手术去除损伤的皮肤，然后移植移植的皮肤。可以通过从身体的健康部位去除皮肤的薄层或皮肤的全部厚度部分来获得皮肤移植物。移植物通常从需要治疗的受试者(自体)或相同物种的另一个体(同种异体)获得。

皮肤移植，重建和整形手术技术是本领域技术人员已知的，例如如以下所描述：Snyder等(应用分层皮肤移植物：分步临床指南和护理含义\"Applying split-thickness skin grafts:a step-by-step clinical guide and nursing implications”，造瘘术伤口护理\"Ostomy Wound Manage”.2001年11月；47(11):20-6)、Jeffrey E.Janis(整形外科学要点\"Essentials of Plastic Surgery”CRC出版，2007年7月22日)、Ziegler,Dietz和Schmidt(皮肤移植.伤口手术\"Skin Grafts.Surgery in Wounds.”2004,179-186页)和Weerda,Hilko(2001)所描述。重建面部整形手术：解决问题的手册\"Reconstructive Facial Plastic Surgery:A Problem-Solving Manual”。Barret-Nerin,Juan；Herndon,David N.(2004).烧伤手术的原理与实践\"Principles and Practice of Burn Surgery”。纽约：马尔赛德克尔出版社。

在本发明的方面和实施方式中，提供HS8用于皮肤移植，重建和整形手术的方法，以帮助皮肤愈合过程和/或接受移植物。HS8可以在移植，重建或手术部位或邻近的位置施用或施用于皮肤。这种应用可以形成手术方法的一部分，或者可以与外科手术方法分开，如在手术后应用于接受移植，重建或整形手术的皮肤区域。

制剂

虽然活性化合物HS8可以单独施用，但优选将其作为药物制剂(例如组合物，制剂，药物)存在，其包含如上所定义的至少一种活性化合物以及本领域技术人员熟知的一种或多种其他药学上可接受的组分，包括但不限于药学上可接受的载体，佐剂，赋形剂，稀释剂，填充剂，缓冲剂，防腐剂，抗氧化剂，润滑剂，稳定剂，增溶剂，表面活性剂(例如，润湿剂)，掩蔽剂，着色剂，调味剂和甜味剂。制剂还可以包含其它活性剂，例如其它治疗剂或预防剂。

因此，本发明进一步提供如上所定义的药物组合物和制备药物组合物的方法，其包括将如上所定义的至少一种活性化合物与本领域技术人员熟知的一种或多种其它药学上可接受的成分混合，例如载体，佐剂，赋形剂等。如果配制为离散单元(例如片剂等)，则每个单元含有预定量(剂量)的活性化合物。

本文所用的术语\"药学上可接受的”涉及在合理的医学判断范围内适合用于与有问题受试者(例如人)的组织接触的化合物，成分，材料，组合物，剂型等，没有过多的毒性，刺激，过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。在与制剂的其他成分相容的意义上，每种载体，佐剂，赋形剂等也必须是\"可接受的”。

合适的载体，佐剂，赋形剂等可以在标准药物文献中找到，例如雷明顿药物科学\"Remington\\\'s Pharmaceutical Sciences”，第18版，马克出版公司，伊斯顿，Pa.，1990和药物赋形剂手册\"Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第2版，1994。

制剂可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。这些方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将活性化合物与载体(例如液体载体，细分散的固体载体等)均匀且紧密地结合而制备制剂，然后如果需要，成型产物。

制剂可以适当地为以下形式：液体，溶液(例如水性，非水性)，悬浮液(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，酏剂，糖浆剂，糖饵剂，漱口剂，滴剂，片剂(包括例如包衣片剂)，颗粒剂，粉剂，锭剂，糖果锭剂，胶囊(包括例如硬和软明胶胶囊)，扁囊剂，丸剂，安瓿，丸剂，栓剂，阴道栓剂，酊剂，凝胶，糊剂，膏剂，霜剂，洗剂，油，泡沫，喷雾剂，雾或气溶胶。

制剂可以适当地提供为贴剂，粘合剂、膏剂，绷带，敷料等，其用HS8和任选的一种或多种其它药学上可接受的成分浸渍，包括例如渗入、渗透和吸收增强剂。制剂也可以适当地以长效剂或储液囊的形式提供。

活性化合物可以溶于、悬浮于一种或多种其它药学上可接受的成分中，或与其混合。活性化合物可以存在于被设计成将活性化合物靶向例如血液成分或一种或多种器官的脂质体或其它微粒中。

适用于非口腔经粘膜给药的制剂包括液体，溶液(例如水性，非水性)，悬浮液(例如水性，非水性)，乳液(例如水包油，油包水)，栓剂，阴道栓剂，凝胶剂，糊剂，膏剂，霜剂，洗剂，油以及贴剂，胶粘剂，长效剂或储液囊。

适用于局部或透皮给药的制剂可以是优选的，并且可以包括凝胶，喷雾剂，糊剂，膏剂，霜剂，洗剂，油剂，油，水溶液，悬浮液和分散体以及贴剂，粘膏剂，绷带，敷料，长效剂或储液囊。

膏剂通常由活性化合物和石蜡或水混溶性软膏基制备。

霜剂通常由活性化合物和水包油膏基制备。如果需要，膏基的水相可以包括，例如至少约30％w/w的多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇，1,3-丁二醇，甘露醇，山梨糖醇，甘油和聚乙二醇及它们的混合物。

局部制剂可期望地包括增强活性化合物通过皮肤或其它受影响区域的吸收或渗透的化合物。这种皮肤渗透增强剂的实例包括二甲基亚砜和相关的类似物。

乳液通常由活性化合物和油相制备，油相可以任选地仅包含乳化剂(另外称为乳化试剂)，或者它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起被包括在内。还优选包括油和脂肪两者。一起地，具有或不具有稳定剂的乳化剂组成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和/或脂肪一起组成所谓的乳化膏基，其形成霜剂油分散相。

合适的乳化试剂和乳液稳定剂包括吐温60，司班80，鲸蜡硬脂醇，肉豆蔻醇，单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。用于制剂的油或脂肪合适选择是基于实现所需要的药物性质，因为活性化合物在可能用于药物乳液制剂的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，应优选霜为非油腻，无污染和可洗涤的产品，具有合适的稠度，以避免从管或其他容器泄漏。直链或支链的一元或二元烷基酯如二异己二酸酯，硬脂酸异鲸蜡酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙酯，硬脂酸丁酯，棕榈酸2-乙基己酯，或可以使用称为Crodamol CAP的支链酯混合物，最后三种是优选的酯。这些可以单独使用或组合使用，这取决于所需的性质。或者，可以使用高熔点脂质如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。

HS8可以应用于皮肤护理中的许多治疗应用，包括伤口愈合和伤口敷料的涂覆技术。因此，制剂可以适当地提供为贴剂，粘合膏剂，绷带，敷料，组织支架(例如参见Zhong等，用于皮肤伤口愈合和真皮重建的组织支架\"issue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction”。科学，1997年4月4日：276(5309)：75-81)，生物材料或类似物，其用HS8和任选的一种或多种其它药学上可接受的成分浸渍或涂覆，包括例如渗入，渗透和吸收增强剂。

包含HS8的药物组合物，药物和其它制剂也可以包含FGF2。由于HS8结合FGF2的能力，HS8可以作为FGF2的载体，有助于将FGF2递送至伤口部位。

给药优选为\"治疗有效量”，这足以修复和/或再生皮肤。给药的实际量，给药速率和时将取决于骨折的性质和严重程度。治疗处方，例如关于剂量等的决定在全科医生和其他医生的责任范围内，并且通常将考虑骨折的性质，个体患者的状况，递送位置，给药方式以及从业者已知的其他因素。HS8剂量的单次或多次给药可以按照处方医师的指导进行。纯粹举例来说，HS8可以以至少1ng/ml，更优选至少5ng/ml和任选10ng/ml或更多的剂量递送。单独的HS8剂量可以是大约小于1mg并且大于1μg，例如，约5μg，约10μg，约25μg，约30μg，约50μg，约100μg，约0.5mg或约1mg之一。上述技术和方案的实例可以在雷明顿药物科学\"Remington\\\'s Pharmaceutical Sciences”，第20版,2000,利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版中找到。

HS8可用于修复和/或再生皮肤以及其它治疗方法，例如施用止痛或抗炎药物。

骨折

在某些方面，本发明涉及HS8治疗骨折的治疗用途(人和/或兽医)。

骨折是一种医学状况。在本申请中，\"骨折”包括骨骼的损伤或伤害，其中骨骼破裂、断裂或碎裂。断裂是指骨骼的不连续。骨折可以由物理冲击、或机械应力或由诸如骨质疏松症或骨关节炎的医学病症引起。

骨折的骨科分类包括闭合或开放和简单或多碎片骨折。在闭合性骨折中，皮肤保持完整，而在开放骨折中，骨可通过伤口部位暴露，这带来更高的感染风险。简单的骨折沿着单线发生，倾向于将骨分为两部分。多碎片骨折将骨分割成多片。

其他骨折类型包括压缩性骨折，压实骨折，螺旋骨折，完全和不完全骨折，横向，线性和斜形骨折以及粉碎性骨折。

在大多数对象中，骨愈合(骨折愈合)自然发生并且在损伤后开始。出血通常导致白细胞和成纤维细胞的凝固和吸引，随后产生胶原纤维。这之后是骨基质(钙羟基磷灰石)沉积(矿化)将胶原基质转化成骨。不成熟的再生骨通常比成熟骨弱，随着时间的推移，未成熟骨经历重塑过程以产生成熟的\"层状”骨。完整的骨愈合过程需要相当长的时间，通常多个月。

其中发生骨折并且可能受益于使用HS8的治疗的骨包括所有骨类型，特别是所有哺乳动物骨骼，包括但不限于长骨(例如股骨，肱骨，趾骨)，短骨(例如腕骨，跗骨)扁骨(例如颅骨，肋骨，肩胛骨，胸骨，骨盆带)，不规则骨(例如椎骨)，籽骨(例如髌骨)。

其中骨折发生并且可以从使用HS8的治疗中受益的骨包括骨架骨(即骨架的任何骨)，颅-面部区域的骨，轴向骨架的骨(例如椎骨，肋骨)，附肢骨(例如四肢的)，骨盆骨骼(例如骨盆)的骨。

其中发生骨折并且可以从使用HS8的治疗中获益的骨还包括头部(颅骨)和颈部的骨，包括面部的那些，例如颚，鼻和颊。HS8可以用于在牙齿或面部或颅骨手术期间辅助骨的修复或再生，这可以包括重建面部和/或口腔的骨骼(与牙齿不同)，例如，包括颚骨。

骨折还包括病理性多孔，例如具有骨质疏松症的对象所显示的。

尽管不限于本发明，HS8的主要作用可以在伤口部位内、邻近伤口部位或被引起迁移到伤口部位中的细胞上，并且可以在伤口床内发现或被引起迁移到伤口床中的间充质干细胞、骨干细胞、前成骨细胞或成骨细胞上，或在任何辅助细胞或血管生成细胞上。

提供了HS8和包含HS8的药物组合物和药物用于治疗哺乳动物对象骨折的方法。治疗可以包括在骨中的伤口愈合。治疗可涉及骨的修复，再生和生长。HS8通过促进新骨生长而促进骨折修复。HS8提高骨折修复的速度，使得骨愈合更快地发生，导致改善的损伤恢复时间。治疗可以导致改善的骨强度。

治疗还可包括治疗骨质疏松症或骨关节炎。

HS8优选施用于骨折周围的组织。这可以包括直接给予已发生骨折的骨组织。施用可以是对围绕骨或骨折的结缔组织或对靠近骨并供应骨的脉管系统(例如血管)。可以直接施用到损伤部位，并且可以施用到通过伤口的初始愈合形成的愈伤组织。根据本发明的药物和药物组合物可以配制用于通过多种途径施用。最优选地，HS8配制成用于注射的流体或液体形式。

在一些实施方案中，HS8配制为控释制剂，例如，在用于植入伤口部位的药物胶囊中。HS8可以附着、浸渍或浸入载体材料(例如生物材料)，例如纳米纤维或可生物降解的纸或织物。

包含HS8的药物组合物，药物，植入物和假体还可以包含FGF2。由于HS8结合FGF2的能力，HS8可以作为FGF2的载体，协助将FGF2递送至伤口部位。

施用优选以\"治疗有效量”施用，其与对应的未治疗骨折相比足以改善骨折的愈合。实际施用的量，施用的速率和时间过程将取决于骨折的性质和严重性。治疗的处方，例如，剂量的决定等在一般医师和其他医疗人员的责任范围内，并且通常考虑骨折的性质，个体患者的状况，递送部位，施用方法和医师已知的其它因素。HS8剂量的单次或多次施用可以根据开处方医生的指导施用。纯粹作为实例，HS8可以以至少1ng/ml，更优选至少5ng/ml和任选10ng/ml或更多的剂量递送。个体HS8剂量可以是小于1mg且大于1μg的级别，例如约5μg，约10μg，约25μg，约30μg，约50μg，约100μg，约0.5mg或约1mg中的一种。上述技术和方案的实例可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams Wilkins中找到。

HS8可以用于在其他治疗时治疗骨折，例如施用疼痛缓解或抗炎药物，骨的固定和设置，例如将损伤的肢体固定在石膏模型中，手术介入，例如，以重置骨骼或移动骨骼以校正位移、角度或脱位。如果需要手术，HS8可以在外科手术期间直接施用于(例如施涂于)骨折。

生物材料

本发明的药物组合物和药物可以采用用HS8涂覆和/或浸渍的生物材料的形式。植入物或假体可以由生物材料形成。这种植入物或假体可以通过手术植入以帮助细胞移植、骨生长、组织再生，组织重构和/或组织重塑。

HS8可以应用于植入物或假体以加速在期望位置处的新组织形成。应当理解，与蛋白质不同，硫酸乙酰肝素是特别强的并且具有好的多的承受制造合成生物支架和应用于植入物和假体所需溶剂的能力。

生物材料可以用HS8涂覆或浸渍。浸渍可以包括通过将HS8与生物材料的组成成分混合来形成生物材料，例如在聚合反应中，或者将HS8吸收到生物材料中。涂覆可以包括将HS8吸附到生物材料的表面上。

当施用或植入对象时，生物材料应允许涂覆或浸渍的HS8从生物材料中释放。生物材料释放动力学可以通过改变生物材料的结构例如孔隙率来改变。

除了用HS8涂覆或浸渍生物材料之外，一种或多种生物活性分子可以浸渍或涂覆在生物材料上。例如，选自下组的至少一种：BMP-2，BMP-4，OP-1，FGF-1，FGF-2，FGF2，TGF-β2，TGF-VEGF；胶原；层粘连蛋白；纤连蛋白；玻连蛋白。除了上述生物活性分子或作为替代，一种或多种二膦酸盐可与HS8一起浸渍或涂覆在生物材料上。有用的二膦酸盐的实例可以包括选自以下的至少一种：依替膦酸盐、氯膦酸盐、阿仑膦酸钠、帕米膦酸二钠、利塞膦酸盐、唑来膦酸盐。

用HS8涂覆或浸渍的生物材料可用于医学和兽医目的。应当理解，本发明可以改善患者的生活质量或潜在地延长动物的生命，例如用于育种的有价值的赛马。

生物材料提供支架或基质支持物。生物材料可适于植入组织中，或可适于施用(例如作为溶液中的微胶囊)。

植入物或假体应是生物相容的，例如，无毒和低免疫原性(最优选非免疫原性的)。生物材料可以是生物可降解的，使得生物材料在伤口愈合发生时降解，最终在对象中仅原位留下再生骨。或者，可以使用不可生物降解的生物材料，例如，以在大的中断上引导骨再生和/或在骨愈合期间用作结构支撑，在成功的伤口愈合之后，生物材料的手术切除是任选的要求。

生物材料可以是软的和/或柔性的，例如，水凝胶，纤维蛋白网或筛，或胶原海绵。\"水凝胶”是当有机聚合物(可以是天然或合成的)凝固或固化以形成捕获水分子或其它溶液并形成凝胶的三维开放晶格结构时形成的物质。凝固可以通过聚集，凝结，疏水相互作用或交联发生。

或者，生物材料可以是相对刚性的结构，例如，由诸如塑料的固体材料或诸如钛的生物惰性金属形成。

生物材料可以具有可以由交联聚合物提供的多孔基质结构。基质优选地对骨生长所需的营养物和生长因子而言是可渗透的。

基质结构可以通过交联纤维例如纤维蛋白或胶原而形成，或由海藻酸钠、壳聚糖或其它具有合适交联剂的多糖(例如钙盐，聚丙烯酸，肝素)的液体膜形成。或者，支架可以形成为凝胶，由胶原或海藻酸盐制备，使用本领域技术人员已知的熟知的方法交联。

用于基质形成的合适的聚合物材料包括但不限于可生物降解/生物再吸收的聚合物，其可以选自：琼脂糖，胶原，纤维蛋白，壳聚糖，聚己内酯，(DL-丙交酯-己内酯)共聚物，(L-丙交酯-己内酯-乙交酯)共聚物，聚乙交酯，聚丙交酯，聚羟基脂肪酸酯，其共聚物，或不可生物降解的聚合物，其可选自：纤维素乙酸酯，纤维素丁酸酯，藻酸盐，聚砜，聚氨酯，聚丙烯腈，磺化聚砜，聚酰胺，聚丙烯腈，聚甲基丙烯酸甲酯，其共聚物。

由于其生物相容性和支持细胞附着和功能的有利性质，胶原是用于基质构建的有希望的材料(美国专利号5,019,087；Tanaka,S.；Takigawa,T.；Ichihara,S.和Nakamura,T.生物可吸收的聚乙醇酸-胶原神经导管的机械特性(Mechanical properties of the bioabsorbable polyglycolic acid-collagen nerve guide tube)Polymer Engineering Science 2006,46,1461-1467)。临床可接受的胶原海绵是基质的一个实例，并且是本领域公知的(例如来自Integra Life Sciences)。

纤维蛋白支架(例如纤维蛋白胶)提供了替代的基质材料。纤维蛋白胶具有广泛的临床应用，作为伤口密封剂，递送生长因子的储库，以及作为生物植入物的放置和固定的辅助(Rajesh Vasita,Dhirendra S Katti.用于组织工程改造的生长因子递送系统：材料前瞻(Growth factor delivery systems for tissue engineering:a materials perspective).Expert Reviews in Medical Devices.2006；3(1):29-47；Wong C,Inman E,Spaethe R,Helgerson S.Thromb.Haemost.2003 89(3):573-582；Pandit AS,Wilson DJ,Feldman DS.作为递送酸性生长因子(FGF-1)的有效运载体的纤维蛋白支架(Fibrin scaffold as an effective vehicle for the delivery of acidic growth factor(FGF-1)).J.Biomaterials Applications.2000；14(3)；229-242；DeBlois Cote MF.Doillon CJ.肝素-成纤维细胞生长因子纤维蛋白复合物：体外和体内应用基于胶原的材料(Heparin-fibroblast growth factor fibrin complex:in vitro and in vivo applications to collagen based materials).Biomaterials.1994；15(9):665-672.)。

Luong-Van等(微胶囊化硫酸乙酰肝素的体外生物相容性和生物活性-In vitro biocompatibility and bioactivity of microencapsulated heparan sulphate Biomaterials28(2007)2127-2136)，通过引用并入本文，描述了HS从聚己内酯微胶囊的延长的局部递送。

生物材料的另一个实例是掺入羟基磷灰石或透明质酸的聚合物。

适合与HS8组合使用的生物材料的一个实例是JAXTM骨空隙填料(Smith和Nephew)。Jax颗粒由高纯度硫酸钙组成并保持其形状，以提供具有受控的颗粒间孔隙和颗粒迁移稳定性的支架。Jax颗粒安全、完整地溶解在体内。

其他合适的生物材料包括陶瓷或金属(例如钛)，羟基磷灰石，磷酸三钙，脱矿骨基质(DBM)，自体移植物(即来自患者组织的移植物)或同种异体移植物(来自非患者的动物组织的移植物)。生物材料可以是合成的(例如金属，纤维蛋白，陶瓷)或生物的(例如由动物组织制备的载体材料，例如非人哺乳动物(例如牛，猪)或人)。

生物材料可以补充以另外的细胞。例如，人们可以用未分化骨前体细胞，如干细胞(例如间充质干细胞，更优选人间充质干细胞)\"接种”生物材料(或共同合成)。

待治疗的对象可以是任何动物或人。对象优选是哺乳动物，更优选人。对象可以是非人哺乳动物(例如兔，豚鼠，大鼠，小鼠或其他啮齿类动物(包括来自任何啮齿目动物的细胞)，猫，狗，猪，绵羊，山羊，牛(包括母牛，如奶牛，或任何牛(Bos)目动物)，马(包括任何马(Equidae)目动物)，驴，和非人灵长类动物)。非人哺乳动物可以是家养宠物，或为商业目的而饲养的动物，例如，赛马，或养殖家畜如猪，绵羊或牛。对象可以是雄性或雌性。对象可以是患者。

如所指出的，根据本发明的方法可以在体外或体内进行。术语\"体外”旨在包括具有培养物中的细胞的程序，而术语\"体内”意图包括具有完整的多细胞生物体的程序。

硫酸乙酰肝素的剂量

在体外和体内用途中，HS8可以以约500ng/ml或更低、更优选250ng/ml或更低、100ng/ml或更低、90ng/ml或更低的浓度或剂量使用80ng/ml或更低、70ng/ml或更低、60ng/ml或更低、50ng/ml或更低、40ng/ml或更低、30ng/ml或更低、20ng/ml或更低、10ng/ml或更低、5ng/ml或更低；或约100mg或更低、50mg或更低、40mg或更地、30mg或更低、20mg或更地、10mg或更低、5mg或更低、4mg或更低、3mg或更低、2mg或更低、或1mg或更低；或约0.3-5μg/ml、0.3-4、0.3-3、0.3-2.5、0.3-2、0.3-1.5、0.3-1.0、0.3-0.9、0.3-0.8、0.3-0.7、0.3-0.6、0.3-0.5、0.3-0.4、1-2、1-1.75、1-1.5、1-1.25、1.25-2、1.5-2,或1.75-2μg/ml的浓度或剂量使用。

FGF2

在本说明书中，FGF2是指成纤维细胞生长因子家族成员的成纤维细胞生长因子2(也称为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或FGF-β)。

FGF2存在于许多组织的基底膜中，并且被认为在没有信号刺激的情况下保持膜结合。FGF2涉及伤口愈合，肿瘤发生和血管生成。

FGF2与其酪氨酸激酶受体的结合刺激了涉及丝裂原活化蛋白激酶(MEK)的激活和细胞外信号相关激酶(ERK)的磷酸化的信号级联(例如参见Ok-Jin Park等，生物化学杂志\"The Journal of Biological Chemistry”，285，(2010)3568-3574)。

来自智人的FGF2的氨基酸序列显示于图28(肝素结合结构域SEQ ID NO：1用下划线标记)。该序列可以在基因库\"Genbank”中获得，登记号为NP_001997.5(G1：153285461)。

在本说明书中，\"FGF2”包括蛋白质或多肽，与图28所示的FGF2的氨基酸序列具有至少70％，更优选75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。

FGF2蛋白或多肽优选还包括肝素结合结构域，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有75％，80％，85％，90％，95％，96％97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

FGF2蛋白或多肽可以是全长FGF2蛋白或多肽的片段或截短物。

FGF2蛋白可以来自或衍生自任何动物或人，例如，非人类动物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括来自啮齿目的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括乳牛、例如奶牛或任何牛属动物)、马(包括任何马科动物)、驴和非人类灵长类动物或其他非人类脊椎动物；和/或非人哺乳动物；和/或人类。

FGF2的剂量

在体外和体内使用中，FGF2可与HS8组合使用。在本发明的一些细胞培养方法中，向培养物中加入外源HS2。FGF2的合适浓度或剂量包括约500ng/ml或更少，更优选250ng/ml或更少、100ng/ml或更少、90ng/ml或更少、80ng/ml或更少、70ng/ml或更少、60ng/ml更少、50ng/ml更少、40ng/ml更少、30ng/ml更少、20ng/ml更少、10ng/ml更少、5ng/ml或更少；或约100mg或更少、50mg或更少、40mg或更少、30mg或更少、20mg或更少、10mg或更少、5mg或更少、4mg或更少、3mg或更少、2mg或更少、或1mg或更少；或介于约0.1-5ng/ml，0.1-0.2、0.1-0.3、0.1-0.4、0.1-0.5、0.1-0.6、0.1-0.7、0.1-0.8、0.1-0.9、0.1-1.0、0.1-1.5，0.1-0.2.0、0.1-2.5、0.1-3.0、0.1-3.5、0.1-4.0、0.1-4.5、0.1-5.0ng/ml。

在一些实施方式中，HS8的体外和体内用途不包括外源FGF2的添加。例如，在本发明的一些细胞培养方法中，不向培养物中加入外源性FGF2。

本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许或明确避免的。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

现在将参考附图通过示例来说明本发明的方面和实施方案。其它方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件通过引用并入本文。

附图说明

现在将参考附图来讨论说明本发明原理的实施方式和实验，其中：

图1.显示不同GAG(5μg/ml)与FGF2(1-100ng/ml)的结合图。在FGF2浓度为0、25、50和100ng/ml时观察到HS8与FGF2的优先结合。从图形顶部向下的数据线：HS8+(5μg/ml)(三角形)，肝素(5μg/ml)(正方形)，Celsus HS(5μg/ml)，HS8-(5μg/ml)，无GAG(菱块)。

图2.显示HS8+(5μg/ml)结合不同蛋白质(0-100ng/ml)的图，显示HS8(5μg/ml)对于FGF2的特异性。从图形顶部向下的数据线：HS8+/FGF2(菱形)、HS8+/FGF1、HS8-/FGF2、HS8+/FGF7、HS8+/BMP2、HS8+/VEGF、SAB/FGF2、HS8+/PDGFBB。

图3.显示响应于HS8治疗，第6天STRO1人间充质干细胞数量随剂量依赖性增加的图。柱从左到右表示：对照、HS8+50ng/ml、HS8+100ng/ml、HS8+500ng/ml、HS8+1000ng/ml、HS8+5000ng/ml、HS8+10000ng/ml。

图4.显示响应于HS8+5000ng/ml(正方形)和对照(菱形)6天内STRO1人间充质干细胞的增殖的图

图5.示出FGF2肝素结合结构域肽的表格。

图6.显示[3H]测试结果图。(A)显示对不同量肽每分钟放射性计数(CPM)的图(B)显示通过亲和层析拉下HS8的图。

图7.说明GAG结合亲和力测定的布置图。

图8.显示与FGF2结合的不同GAG浓度的优化图。(A)肝素(2.5、5、10μg/ml)和FGF2 0、25、50、100ng/ml-SAB/0.2％鱼明胶/ExtrAvidin AP 220ng/ml。(B)HS8+(2.5、5、10μg/m1)和FGF2 0、25、50、100ng/ml-SAB/0.2％鱼明胶/ExtrAvidin AP 220ng/ml。(C)Celsus HS(2.5、5、10μg/ml)和FGF2 0、25、50、100ng/ml-SAB/0.2％鱼明胶/ExtrAvidin AP 220ng/ml。(D)HS8(-)(2.5、5、10μg/ml)和FGF2 0、25、50、100ng/ml-SAB/0.2％鱼明胶/ExtrAvidin AP 220ng/ml。

图9.显示不同GAG(2.5μg/ml)与FGF2(0、25、50、100ng/ml)-SAB/0.2％鱼明胶/ExtrAvidin AP 220ng/ml结合的图。

图10.显示(A)HS8(HS8+)和(B)HS8(-)结合不同蛋白质的图。(A)HS8+5μg/ml与不同蛋白质SAB/0.2％鱼明胶/22ng/ml ExtrAvidin AP。(B)HS8(-)5μg/ml与不同蛋白质SAB/0.2％鱼明胶/22ng/ml ExtrAvidin AP。

图11.显示肝素珠测定结果的图(A)FGF2优化。(B)肝素珠与外源性肝素竞争。(C)与不同GAG的肝素珠的竞争百分比。

图12.显示STRO1(p7)增殖测定结果的图。(A)各天的活细胞计数。(B)累积细胞生长。

图13.显示HM21(p5)增殖测定结果的图。(A)各天的活细胞计数。(B)累积细胞生长。

图14.显示STRO1(p5)和HM21(p5)增殖测定结果的图。(A)具有HS8+的第6天的活细胞计数。(B)培养基变化不同时间间隔的STRO1细胞增殖。

图15.显示通过GAG结合平板(艾度仑-Iduron)评估不同GAG对FGF2的结合能力的图。HS8(HS8+)部分结合FGF2，与肝素差不多，并优于原料Celsus HS和HS8-流过物。

图16.显示通过GAG结合平板(艾度仑-Iduron)评估不同GAG对肝素结合生长因子(HBGF)BMP-2、FGF1、FGF2、FGF7、PDGF-BB和VEGF的结合能力的图。(A)Celsus HS，(B)HS8，(C)HS8-部分，(D)肝素。HS8(HS8+)部分比所有其他HBGF优先结合FGF2且甚至比肝素更好。对任何HBGF，HS8-和原料Celsus HS显示极小的偏好。

图17.显示通过36小时BrdU掺入监测的人间充质干细胞对HS8(HS8+)的剂量反应的图。FGF2用作给药阳性对照。与测试的其他GAG相比，HS8+部分提供了显著更多的刺激。

图18.显示在指定时间(天)内由Guava ViaCount(FACS)方法监测的人间充质干细胞对HS8(HS8+)(顶部)和FGF2(底部)的剂量反应的图。FGF2用作给药阳性对照(底部图)。HS8提供显著的刺激。

图19.显示在指定时间(天)内由Guava ViaCount(FACS)方法监测的人类间充质干细胞对增加浓度的不同GAG的剂量反应的图。HS8(HS8+)趋向于更高的细胞数。

图20.显示人间质干细胞对增加浓度的不同GAG的剂量反应的图，通过Guava ViaCount(FACS)细胞计数法监测至多7代。FGF2单独给予最高的刺激；两种浓度的HS8(HS8+)趋向于较高的细胞数，类似肝素。

图21.hMSC(隆萨-Lonza)干细胞的代表性FACS免疫表型分析结果的图示，基于以下标记：(A)阴性标记：CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR和(B)阳性标记：CD73、CD90、CD105、STRO-1、SSEA-4、CD49a。

图22.在无补充(对照)，HS8(HS8+)，HS8-，原料Celsus HS(CHS)或FGF2单独中生长7代的FACS免疫表型的hMSC干细胞的定量表。表格显示表达相关细胞表面标志物CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105、CD49a、SSEA-4、STRO-1的细胞百分比。

图23.在无补充(对照)，HS8(HS8+)，HS8-，原料Celsus HS或FGF2(2.5ng/ml)单独生长4至7代的FACS免疫表型hMSC干细胞的图形表示。(A)CD49a，(B)SSEA-4，(C)STRO-1。

图24.在含有无补充(对照)，肝素，Celsus HS，HS8-和HS8(HS8+)的培养基中培养hMSC4至7代(P4，P7)后hMSC CFU测定培养板的(A)图形表示和(B)显微照片。

图25.显示在含有无补充(对照)，HS8(HS8+)，HS8-，Celsus HS，肝素和FGF2的培养基中培养hMSC4至7代(P4，P7)后，hMSC分化成骨(顶部，茜素红)和脂肪(底部，油红O)细胞的能力的显微照片。

图26.HS8增强FGF-2介导的MSC生长。图示显示在正常维持(对照)培养基中，或用含有不同剂量的HS8(μg/ml)和固定剂量的FGF-2(0.156ng/ml)的培养基培养4天后的hMSC的细胞数。

图27.HS8维持FGF-2信号传导。在HS8和/或FGF-2刺激后30分钟和24小时Western印迹显示ERK1/2磷酸化和FRS2a磷酸化。

图28.人FGF2的氨基酸序列。SEQ ID NO：1以下划线显示。

图29.来自E10神经上皮的硫酸乙酰肝素(HS2)的亚硝酸衍生的二糖组成。放射性标记的HS通过用低pH值HNO2的脱氨解裂解聚。在HNO2处理GAG后分离出二糖，然后样品在1×120厘米Bio-Gel P-2柱上运行。所得的二糖通过SAX-HPLC分级。积分峰下面积以得到二糖组成，随后得到每个样品中的百分比组成。

图30.肝素裂解酶处理后来自E10神经上皮的硫酸乙酰肝素(HS2)的二糖组成。硫酸乙酰肝素用乙酰肝素裂解酶的混合物完全解聚。得到的不饱和二糖在P-2柱上分离，通过强阴离子交换柱色谱分离。将每个所得曲线下的面积积分，以计算每个样品中每个二糖的百分比。数字表示两次运行的平均值(对于主GAG样本)和三次运行(2.3D派生样本)的平均值。从每个样品回收超过97％的二糖。

图31.Celsus HS，HS8和HS3(D2O溶液)的1H NMR。

图32.Celsus HS，HS8和HS3(D2O溶液)的1H NMR的特写。

图33.Celsus HS#10697和HS8的HPLC-SEC-RI色谱图，在2x Superdex肽柱上分离，用50mM乙酸铵洗脱。

图34.硫酸乙酰肝素的HPLC-SEC-RI色谱图。Celsus HS#10697；不保留BMP2(848/HS3/001)；保留BMP2(HS3)(848/HS3/001)；初始运行(HS3-001-01)；最终运行(HS3-001-02)。HS3制剂在约15ml时显示高峰(0.06-0.08)。

图35.来自Celsus的HS制剂HS#10697和HS#10595的肝素裂解酶I，II和III消化物的HPLC-SEC-RI。一式两份进行肝素裂解酶消化。垂直线表示二糖和聚合度(dp)大于2的寡糖的洗脱被切断。

图36.HS8(宽峰在18-20ml)、HS3-001-01(峰在19-20ml)的HPLC-SEC-RI色谱图，在2×Superdex肽柱上，用50mM乙酸铵洗脱。

图37.显示肝素结合SEQ ID NO：1的图。

图38.显示HS8结合固定化肝素能力的图。

图39.显示通过亲和层析(用SEQ ID NO：1衍生的柱)FGF-2结合纯化的HS8的能力的图。将其与原料HS(HS-PM猪粘膜)或无糖对照的结合进行比较。

图40.显示在HS8存在下，经6天显示贴附塑料间充质干细胞的增殖的图。

图41.显示在分离的HS8存在下经过36小时通过STRO-1-分离的间充质干细胞的BrDU测量增殖图，与原料Celsus HS(HS-PM)或未结合的HS流通物相比较。

图42.显示Celsus HS的归一化二糖组成的图。对同一样品将Celsus HS Lot#10697的消化与先前的分析进行比较。

图43.显示HS3的归一化二糖组成的图。HS3-001-01消化比较。

图44.显示Celsus HS，HS8和HS3的二糖组成的图。

图45.显示Celsus，HS，HS3和HS8的二糖组成百分比的表格。

图46.显示在无HS，肝素，HS8，Celsus HS(HSPM)或HS8-存在下FGF-2的稳定性的图。在HS8存在下，FGF-2稳定。

图47.显示SU5402(FGFR1抑制剂)阻断HS8刺激hMSC增殖的图。

图48.显示IMB-R1(FGFR1中和抗体)抑制HS8刺激的hMSC增殖的图。

图49.显示IMB-R1(FGFR1中和抗体)抑制HS8刺激的hMSC增殖的图。

图50.显示FGF2中和抗体抑制HS8刺激的hMSC增殖的图。

图51.显示在HS8补充培养基中扩增的人MSC为更多克隆形成性(3个单独的供体)的图。

图52.显示在大鼠临界大小颅盖缺损模型中HS8显著增强骨愈合的图和微CT分析。

图53.显示使用和不使用HS8治疗全层皮肤切除伤口(6毫米活检穿孔)猪模型的结果照片。(A)第0天伤口，(B)单独用载体(CMC)处理的猪第7天时的伤口，和(C)用载体+HS8(250ug/cm3)处理的猪第7天时的伤口。

发明详述

本发明的一个或多个实施方式的细节作为示例在以下随后的说明书中阐述，包括发明人为实施本发明而设想的最佳模式的具体细节。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明可以在不限制于这些具体细节的情况下实施。

实施例

实施例1

我们调查了一种新型FGF2结合性HS的纯化方法，其源自市售猪Celsus硫酸乙酰肝素，适合用于易于临床使用的硫酸乙酰肝素(HS)制剂的规模化。

选择来自FGF2的肝素结合结构域(HBD)肽序列GHFKDPKRLYCKNGGF[SEQ ID NO：1](糖胺聚糖的结构及其与蛋白质的相互作用\"The structure of glycosaminoglycans and their interactions with proteins”；Gandhi NS和Mancera RL，Chem Biol Drug Des.2008年12月；72(6)：455-82)，并用于纯化与FGF2结合的特异性HS物质。

在合成肽后，对其进行3H肝素测定，其中以剂量依赖的方式3H肝素与特异性结合浸泡到硝酸纤维素膜的肽，与3H肝素的总计数进行比较。一旦显示出3H肝素与FGF2-HBD肽的特异性结合，使用该肽从通过亲和层析结合于FGF2的猪Celsus HS拉下特异性HS。这种新的HS物质被命名为HS8(被赋予变体名称HS8G)。

分析HS8与FGF2与糖胺聚糖(GAG)结合平板结合的特异性，其中测定HS8与FGF2的特异性结合，与肝素，猪Celsus HS和HS8阴性部分相比较。

将GAG接种在GAG结合板(5μg/ml)上过夜，然后与重组人FGF2(0-100ng/ml)一起温育，并使用ELISA方法检查GAG与FGF2结合的特异性。

结果清楚地表明，与其他GAG物质相比，HS8更多地与FGF2的结合(图1)。将HS8结合FGF2的能力与其他生长因子(VEGF，BMP2，PDGFBB，FGF1和FGF7)进行比较，显示HS8对FGF2的特异性(图2)。

HS8也用于体外进行STRO1人间充质干细胞(hMSC)细胞增殖测定，以确定HS8的生物活性。我们在hMSC的短期生长中使用不同剂量(50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml，5000ng/ml和10000ng/ml)HS8作为独立培养基，与对照相比。没有外源生长因子的任何添加，我们观察到采用HS8与hMSC的剂量依赖性生长(图3和图4)。

实施例2

间充质干细胞(MSC)

MSC被广泛定义为塑料贴壁细胞，其可以在体外被引导以分化为成骨的，软骨形成的，脂肪形成的，肌原性的和其他的谱系，并且最近，国际细胞疗法学会也将\"多能间充质基质细胞”命名为MSC(Zulma等，2011)。在骨髓，脂肪组织，皮肤组织，椎间盘，羊水，各种牙科组织，人胎盘和脐带血中发现MSC(Si等，2011和Zulma等，2011)。已经认识到MSC的治疗潜力，并被用于许多临床应用中，例如骨组织再生和非骨骼组织再生。近年来，描述了MSC的免疫抑制和抗炎作用。这是由于MSC通过在其细胞表面上表达低水平的主要组织相容性复合物-I分子(MHC-1)的弱免疫原性，抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活和增殖的能力和修饰损伤组织的微环境同时保护受损组织(Si等，2011和Zulma等，2011)。可以有效地用于治疗GVHD的MSC介导的免疫抑制机理上具有物种变异(Ren等，2009和Shi等，2010)。细胞因子引发的小鼠MSC由一氧化氮(NO)介导，细胞因子引发的人类MSC通过吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)进行。

肝素和硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(HSGAG)

肝素产生并储存在肥大细胞中，HSGAG在所有动物组织中都可以发现，它们可以作为蛋白多糖发生，其中HS链与细胞表面或ECM蛋白结合。HS影响代谢，运输，信息传递，细胞粘附，细胞生长和分化以及所有器官系统的支持(Bishop等，2007和Gandhi等，2008)。肝素和HS是由重复的糖醛酸-(1→4)-D-葡糖胺二糖亚基组成的线性多糖。糖醛酸可以是D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸。此外，在特定位置的修饰产生不同的N-硫酸化，O-硫酸化和N-乙酰化复合物序列[Ori等，2008]。肝素中最丰富的二糖是ldoA(2S)-(1→4)-GlcNS(6S)，因此在整个链长度上引起高度负电荷，这使得肝素在结合蛋白质时更少或没有选择性。另一方面，HS具有未硫酸化的GlcA-(1→4)-GlcNA二糖作为最常见的形式，其引起非硫酸化NA结构域的分离嵌段和高度硫酸化的肝素样IdoA-(1→4)-GlcNS二糖(NS结构域)嵌段。NA和NS结构域由NA/NS过渡域分开。HS结构的多样性负责广泛的生物功能。

成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白和肝素结合结构域

成纤维细胞生长因子(FGF)是人类中包含22个成员的大家族多肽生长因子。它们在发生、分化、细胞增殖、血管发生和通过结合并激活被称为FGF受体(FGFR)的FGF细胞表面受体酪氨酸激酶亚类的伤口愈合中发挥重要作用(Ornitz等，1996)。此外，FGF是研究最多的肝素结合蛋白，HSGAG通过与FGFR直接分子结合调节FGF信号传导(Pellegrini，2001)。此外，通过FGFR1的FGF2信号传导对于MSC扩增是重要的(Gronthos等，1999)。

肝素/HS与FGF2的相互作用

各种研究已经认识到蛋白质的肝素/HS结合位点的常见结构特征(Gandhi等，2008；Hileman等，1998和Ori等，2008)。Cardin和Weintraub于1989年首次尝试在分析21种肝素结合蛋白后测定肝素结合结构域(HBD)，并提出典型的肝素结合位点可能具有序列XBBXBX或XBBBXXBX，其中B为带正电荷的氨基酸(精氨酸，赖氨酸和很少组氨酸)，X是亲水残基。下一个共识序列TXXBXXTBXXXTBB，在比较几种蛋白质的X射线和NMR之后，由Hileman等人在1998年引入。在该序列中，T定义回转，B是碱性氨基酸(精氨酸或赖氨酸)和X为亲水残基。

在GAG和具有带正电荷的碱性氨基酸的蛋白质之间预期强的离子相互作用与肝素链上带负电荷的硫酸盐或羧酸酯基团形成离子键。它们的作用决定了与肝素，以及可能地，于HS中像NS结构域的高度硫酸化区域的相互作用(Fromm等，1997和Ori等，2008)。此外，还有其他类型的键，即范德华力，氢键和疏水相互作用。这些键将与更多异质HS相互作用，其中中性氨基酸也是必需的(Fromm等，1997和Ori等，2008)。在考虑FGF2时，谷氨酰胺和天冬酰胺氨基酸除了与离子键之外还通过与糖的羟基形成氢键，在与HS的相互作用中起重要作用(Thompson等，1994)。

根据迄今为止众多已发表的研究，有不同的肽序列作为FGF2的肝素结合结构域，其中已经编译在表1中。这里我们采用了一个编号系统，其中氨基酸根据完整的FGF2序列(288aa)编号。

移植物抗宿主病(GVHD)

造血细胞移植(HCT)是一种用于治疗每年增加的同种异体HCT手术的血液恶性疾病的强化疗法(Ferrara等，2009)。HCT的主要并发症是GVHD，主要影响胃肠道，肝脏，皮肤和肺部的免疫学疾病。根据Billingham，1966-67年，如果GVHD发生，应该满足三个要求，即1)移植物必须含有免疫感受态细胞，其为T淋巴细胞，2)受体必须表达移植供体中不存在的组织抗原，以及3)患者必须无法产生有效的应答以消除移植细胞。当使用清髓性调理方案去除宿主有缺陷的骨髓时，GVHD病理生理学开始。由于受损组织产生的细胞因子(TNFα，IL1，LPS)，宿主的抗原呈递细胞被激活。一旦在此阶段进行同种异体HCT，T细胞被激活，从而产生更多的细胞因子，导致GVHD的细胞和炎症反应。非造血干细胞；MSC，可以减少同种异体T细胞的反应，因其有效的免疫抑制和改善GVHD(Le Blanc等，2008；Meuleman等，2009和Toubai等，2009)。

需要将hMSC扩大到治疗目的

基于细胞的疗法中使用hMSC的主要缺点是尽管已经用于临床，但难以获得足够的细胞数。少量的hMSC，其可以低至0.01％至0.0001％的骨髓单核细胞阻碍其广泛使用。根据Caplan，2009年，他们从不同年龄的捐赠者获得骨髓，分散，放置于培养瓶，随后计数CFU-Fs，并以相对每有核髓细胞的MSC通过十年的年龄显示。观察到每有核骨髓细胞的MSC显著减少，从出生到青少年减少10倍，并且从青少年向老年人减少10倍。显然，随着年龄的增长，骨髓中MSC的数量减少。此外，Caplan指出，这些减少与观察到的年轻人和成年人的骨折愈合率平行。相比之下，骨髓中造血干细胞的滴度为每104个有核髓细胞约1个，在个体的整个年龄保持不变。

hMSC目前的扩增方法

研究人员认为，如果他们能够模拟骨髓微环境培养hMSC，可以实现治疗数量的hMSC供临床使用。基本上，模拟可以通过两种广泛的方式来实现，即用ECM和用外源生长因子补充生长hMSC。当使用ECM基底时，观察到增加的hMSC贴壁和累积的细胞数(Grünert等，2007和Matsubara等，2004)，但是，扩增的细胞缺乏干细胞特性(Cool等，2005)。此外，与标准培养基的对照相比，FGF2通常用作外源性生长因子补充，其也显示出细胞数量的显著扩增(Ling等，2006和Sotiropoulou等，2006)。与用ECM基底生长的细胞一样，与对照组中的多潜能hMSC相比，用FGF2生长的细胞也具有增加数量的分化祖细胞(Gronthos等，1999和Walsh等，2000)。因此，鉴定促进hMSC增殖的分子，其中我们可以实现治疗数量的hMSC，而不会不利地影响其干细胞特性，这在临床使用hMSC用于骨再生和骨髓移植以减轻GVHD方面表现出巨大的前景。

HS GAG促进hMSC的生长而不影响细胞的干细胞特性

Nurcombe等人在1993年已经表明，FGF对由HS GAG调节的鼠神经前体细胞的活性和这种相互作用是FGF2与其受体结合的要求。此外，HSGAG与FGF的结合存在显著差异，其中在第9天由这些细胞产生的HS GAG优先结合FGF2和第11天，HSGAG结合转移至FGF1。此外，这些独特的硫酸乙酰肝素通过与神经前体细胞上的细胞表面受体相互作用介导FGF2与特异性受体的结合(Brickman等，1995)。1998年，Brickman等人通过分离和表征来自永生化胚胎10天小鼠神经上皮2.3D细胞的两个单独的HS库来进一步支持这些发现。一个库源自对数生长期的细胞，其增加了FGF-2的活性，另一个库来自接受接触抑制和分化的细胞，其偏好于FGF1。如我们实验室先前所述，称为HS2的胚胎HS GAG制剂促进hMSC生长而没有明显的多潜能损失，并且在体内移植时导致小鼠骨形成增加。这一证据表明，ECM组分HS GAG可以改善hMSC的生长，而不会对多潜能产生不利影响。因此，特别需要对FGF2具有高结合亲和力并增强其对细胞生长的活性的HS变体，其与HS2相比可以容易地放大以用于临床设置。

结果

通过柱色谱法分离对FGF-2具有更高结合亲和力的硫酸乙酰肝素(HS8)

根据纯化FGF2结合性HS2的策略，我们寻求从市售的猪Celsus硫酸乙酰肝素来源(Celsus实验室，USA)纯化另一种FGF2结合性HS的可能性，以便扩大HS制剂，其可以容易地用于临床。在表1中所示的这些肽序列外，使用了称为FGF2-Gandhi-HBD的157GHFKDPKRLYCKNGGF172(Gandhi等，2008)。

[3H]肝素测定

在合成肽后，对其进行3H肝素测定，其中测试FGF2-HBD-肽与肝素结合的能力。将已知量的肽或饱和量的肽干燥到相同的硝酸纤维素膜上，首先空气干燥，然后在80℃的真空烘箱中进一步干燥45分钟。然后用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤膜，并在计数小瓶中用4％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)/PBS中的0.1μCi[3H]肝素(铂金埃尔默-Perkin Elmer，波士顿，美国)孵育。洗涤膜之后通过铂金埃尔默Tri-Carb 2800TCR液体闪烁计数仪测定放射性。

当使用已知量的肽(SEQ ID NO：1)时，它们显示增加的CPM剂量依赖性，其中使用BMP2-HBD作为阳性对照[图6(A)]。但是当硝酸纤维素膜在500μg/ml肽溶液中饱和时，显示出最高的计数。对于每个肽，在500μg/ml溶液水平下计算出净[3H]肝素的CPM百分比。BMP2-HBD(7.2％)最高，其次是FGF2-Gandhi-HBD(4.97％)。根据从[3H]肝素测定获得的结果，通过亲和层析使用FGF2-Gandhi-HBD从猪Celsus HS拉下对FGF2具有较高亲和力的结合性HS(HS8)。色谱图如图6(B)所示。

HS8的表征

GAG结合亲和力测定

采用96孔GAG结合板(艾度仑-Iduron，英国)对HS8进行亲和结合FGF2和其他蛋白质(R D系统)，其中检测HS8+与FGF2的特异性结合，与肝素(西格玛-Sigma)，猪Celsus HS(Celsus实验室，美国)和HS8阴性部分比较。将GAG接种在GAG结合板(2.5-10μg/ml)上过夜，并在标准测定缓冲液(SAB)中用0.2％的鱼粉明胶(西格玛)在37℃封闭1小时。

然后在37℃下采用200μl/孔0-100ng/ml重组人FGF2孵育2小时，然后在37℃下用200μl/孔的250ng/ml初级生物素化抗体(R D系统)孵育1小时。在下一步中，采用200μl/孔220ng/ml ExtrAvidin-AP(Sigma)在37℃温育板30分钟。从过夜培养直到该步骤在每个步骤之间用SAB洗涤板3次。最后，用2200μl/孔SigmaFAST p-硝基苯基磷酸盐(西格玛)孵育40分钟，并通过Victor3 1420多标记计数器(铂金埃尔默)在405nm处读取吸光度。

所有测试的3种浓度(2.5、5和10μg/ml)中的所有GAG与FGF2的结合与增加量的FGF2类似地增加，并在100ng/ml FGF2下达到饱和(图8)。当结合FGF2测试不同的GAG时，结果清楚地表明HS8+具有与其他GAG物质与FGF2最高结合亲和力(图9)。当在100ng/ml FGF2点比较Celsus HS:HS8+的折叠差异时，该比率为1：1.51。

然后我们测试了HS8+和HS8(-)部分结合不同蛋白质的能力(图10)。与VEGF、BMP2、PDGFBB、FGF1和FGF7相比，HS8+与FGF2结合具有更高的亲和力[图10(A)]。另一方面，与其他蛋白质相比，HS8(-)部分与FGF1结合的亲和力最高[图10(B)]。

在Ono等人，1999修改的该测定中测试不同GAG与肝素竞争FGF2的能力。在微管中将具有不同浓度GAG与已知浓度的FGF2(R D系统)在室温(RT)下混合30分钟。

向其加入40μl珠溶液[20μl肝素-琼脂糖珠(I型，西格玛)和聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P-30，伯乐公司-Bio-Rad)]，并在室温下混合30分钟。将肝素珠用BSA-PBS(PBS中1％BSA)通过离心(2000rpm，1分钟)洗涤3次并用PBST(含有0.02％吐温的PBS)洗涤3次，每个管中加入100μl的1：500的生物素化加入抗FGF2(R D系统)并在室温下孵育1小时。在如上洗涤后，加入100μl的1：10TMB底物(R D系统)并在室温下混合30分钟。加入终止溶液(50μl 2N H2SO4)，离心后将100μl上清液转移至96孔板。通过铂金埃尔默Victor31420多标记计数器在450nm处读取吸光度。

首先，通过FGF2优化测量与添加量的肝素珠结合所需的FGF2量，并且为下一组实验选择20ng/ml的FGF2剂量[图11(A)]。

然后为了获得在竞争测定中使用的GAG的范围，我们最初使用不同量的肝素。加入50μg肝素几乎足以与附着在珠上的内肝素竞争[图11(B)]。因此，我们在竞争测定中使用0-50μg GAG[图11(C)]。当考虑到竞争百分比，肝素是最具竞争力的，通过加入50μg，达到约13％，其次是HS8+43％，Celsus HS 50％和HS8(-)63％。

增殖测定

在来自21岁的西班牙裔男性供体的这种测定中使用两种hMSC，其中为通过磁性活化细胞分选分离的STRO1阳性细胞(第5-7代)和通过常规塑料贴壁分离的HM21细胞(第5代)。将细胞接种，以3000个细胞/cm2的接种密度，并使其附着于板上24小时。然后将不同浓度的HS8+作为独立培养基补充剂，范围为50-10000ng/ml，作为阳性对照的2.5ng/ml人重组FGF2(R D系统)加入到培养基中。培养基更换在2或3天进行。

在STRO1细胞中，每2天进行培养基更换，随着浓度的增加，HS8+与对照组相比增加了活细胞计数且经6天，5000ng/ml给出最高的计数(图12)。比较HM21细胞，其中每3天进行培养基更换，显示出与第6天时10000ng/ml的对照相比略高的计数(图13)。

由于在两种细胞类型的活细胞计数中观察到显著性差异，我们进行了扩增测定，其中第5代STRO1和HM21细胞进行6天，并与对照进行比较，其每3天进行培养基更换。与HM21细胞相比，STRO1显示略高的增殖计数，但是在两种细胞类型中，对照和处理的细胞几乎都产生相同的细胞计数[(图14(A)]。然后我们根据更换培养基不同的时间间隔，在第6天用前面实验的数据计算STRO1细胞，细胞计数/cm2[图14(B)]。有趣的是，当每2天进行一次培养基更换时，与每3天更换相比，在对照组和处理的细胞中都能产生更多的细胞计数。此外，当每2天进行培养基更换时，处理的细胞计数高于未处理的对照。

总结

我们使用序列157GHFKDPKRLYCKNGGF172通过亲和层析从猪Celsus HS制备与FGF2更高亲和力结合的HS(HS8)。

在糖胺聚糖(GAG)结合测定结果中，其清楚地表明与其他GAG物种相比，HS8+具有与FGF2结合的最高亲和力。此外，Celsus HS：HS8+在100ng/ml FGF2点的倍数差异为1；1.51。在考虑到竞争百分比的肝素珠竞争测定中，肝素是最具竞争力的，通过加入50μg达到约13％，其次是HS8+43％，Celsus HS 50％和HS8(-)63％。通过磁激活细胞分选分离的STRO1+hMSC和通过常规塑料贴壁分离的HM21hMSC用于细胞增殖测定，其中当HS8+以5μg/ml的浓度用作独立培养基补充时，当培养基每2天进行更换时，获得更高的细胞计数。总之，我们现在已经从具有较高的对FGF2的结合亲和力和提高hMSC增殖能力的商业化的硫酸乙酰肝素源库中成功地将对FGF2具有更高结合亲和力的硫酸乙酰肝素(HS8)分离出来。

总之，我们现在已经从商业上可获得的硫酸乙酰肝素源库中成功地将对FGF2具有较高结合亲和力的硫酸乙酰肝素(HS8)分离出来，并且显示与其他包括肝素在内的GAG相比，它具有更高的结合能力。另外HS8+作为独立培养基补充时，当每2天进行培养基更换时促进细胞增殖。因此，我们相信我们已经通过在硫酸硫酸乙酰肝素(HS8)中培养这些细胞来满足对高质量离体扩增的MSC的需求，HS8被改造成对FGF2具有高亲和力。

其他研究

分离FGF2的特异HS(HS8)

尽管我们已经成功地实现了分离HS8，对FGF2具有更高的结合亲和力的HS，但我们将以[3H]肝素测定法，GAG结合测定法和细胞附着法(根据Lee等，2007)进一步测试其它FGF2HBD肽序列(表1)。

结合亲和力测定

HS8的结合亲和力已经被GAG结合板证实，并且将通过斑点印迹测定和与BIAcore T100的动力学结合进一步验证(Cain等，2005)。

竞争测定

ELISA方法的结果将通过蛋白质印迹法进一步证实。

增殖试验

通过使用更多的hMSC系以及较低传代的细胞将进一步验证增殖测定的结果。此外，短期增殖试验将通过使用BRDU(罗氏-Roche)和WST-1(罗氏)试剂进行。

二糖分析

HS8的二糖分析将使用根据Murali等人，2009年的阴离子交换色谱法进行并可以揭示HS8的组成。

FGF2的稳定性

稳定性测定将以SYPRO测定和FGF2定量测定进行。在SYPRO测定中，FGF2蛋白与GAG的相互作用将通过特定的Sypro橙染料(Uniewicz等，2010)测定蛋白质的变性温度。FGF2定量测定将按照制造商(R D系统SystemsELISA目录号DFB50)的建议进行，以测量细胞培养物中FGF2的浓度。结果如图46所示。

体外检查用HS8生长的hMSC的生物活性

将检查塑料贴壁、分化成骨、成脂和软骨组织的多能性，且FACS用作表面标志物(Dominici等，2006)。CFU-Fs测定将从具有或不具有HS8的扩增hMSC和骨髓抽吸物进行(Cawthon，2002和Guillot等，2007)。hMSC的免疫调节活性将通过混合T淋巴细胞检测来评估。

体内检查HS8生长的hMSC的生物活性

在HS8存在下分离和生长的细胞将用于小鼠骨再生模型(Zannettino等，2010)，并且还将用于GVHD的异种人NOD-SCID小鼠模型(Tiasto等，2007和Toubai等，2009)。

实施例3

使用GAG-结合板(艾度仑-Iduron)评估不同GAG对FGF2的结合能力。还使用GAG结合板(艾度仑-Iduron)评估不同GAG对肝素结合生长因子(HBGF)、BMP-2、FGF1、FGF2、FGF7、PDGF-BB和VEGF的结合能力。使用的材料和方法如下。

发现HS8结合FGF-2几乎与肝素一样好，肯定比原料Celsus HS和HS8-流过部分好(图15)。

HS8(HS8+)优先于所有其他测试HBGF结合FGF2，并对FGF2的结合能力高于肝素，即HS8表现出与FGF2的特异性结合。HS8-和原料Celsus HS显示对任何测试的HBGF很少的偏好(图16)。

材料

1.标准测定缓冲液(SAB)–100mM NaCl，50mM乙酸钠，0.2％v/v吐温20，pH 7.2

2.封闭缓冲液–0.4％鱼明胶(西格玛目录号67041)+SAB

3.GAG结合板(艾度仑，英国)

4.来自R D系统的蛋白质：BMP2–目录号355BM、FGF 1–目录号231BC、FGF 2–233FB、FGF7–Cat No、251KG、PDGF BB–目录号220BB、VEGF–目录号293VE

5.来自R D系统的抗体：BMP2-目录号BAM 3552，FGF1-目录号BAF232，FGF2-BAM233，FGF7-目录号BAF251，PDGF BB-目录号BAF220，VEGF-目录号BAF293

6.ExtraAvidin-AP(西格玛a目录号E2636)

7.Sigma快速磷酸对硝基苯酯(西格玛，N2770)

方法

1.将GAG溶解在SAB中(5μg/ml)

2.将200μl GAG溶液/孔加入GAG结合板中，并在室温避光孵育过夜

3.用SAB将板仔细洗3次，250μl/孔

4.在37℃下用250μl/孔封闭缓冲液避光孵育板1小时

5.用SAB将板仔细洗3次，250μl/孔

6.用封闭缓冲液溶解蛋白质并进行连续稀释：0、0.781、1.56、3.125nM

7.将200μl/孔稀释的蛋白质分配到GAG包被的板上，并在37℃下孵育2小时

8.用SAB将板仔细洗3次，250μl/孔

9.在封闭溶液中加入200μl/孔的250ng/ml生物素化一抗，并在37℃下孵育1小时

10.用SAB将板仔细洗3次，250μl/孔

11.在封闭溶液中加入200μl/孔的220ng/ml ExtraAvidin-AP，并在37℃下孵育30分钟

12.用SAB将板仔细洗3次，250μl/孔

13.加入200μl/孔显影剂：在DI水中的Sigma快速磷酸对硝基苯酯并在室温下孵育40分钟

14.在405nm处读取吸光度

实施例4

进行BrdU掺入增殖试验以确定HS8对hMSC增殖的影响(下文描述方案)。

通过BrdU掺入在36小时内监测人间充质干细胞对HS8(HS8+)的剂量反应。FGF2用作给药阳性对照。发现HS8+能增强hMSC的增殖，并提供比其他GAG更多的刺激(图17)。

方案(细胞增殖ELISA，BrdU(比色)罗氏)

1.接种细胞-在190μl培养基/孔(96孔板)中的5000个细胞

2.培养基-1000mg/L DM EM+10％胎牛血清(FCS)+1％2mM L-谷酰胺+1％青霉素和链霉素

3.在37℃和5％CO2条件下孵育6小时

4.培养6小时后，在指定的孔中加入10μl培养液中不同剂量的处理物

5.FGF2(ng/ml)和GAG(g/ml)-10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125

6.在37℃和5％CO2条件下采用处理物孵育36小时

7.将BrdU添加到每个孔中

8.在37℃和5％CO2条件下用BrdU标记细胞2小时(加入20μl的BrdU标记溶液/孔)

9.通过轻叩去除标记培养基

10.向细胞中加入200μl/孔FixDenat，并在15-25℃下孵育30分钟

11.通过轻弹和敲击彻底去除FixDenat溶液

12.加入100μl/孔抗BrdU-POD工作溶液，并在15-25℃下孵育90分钟

13.通过轻弹去除抗体结合物并用250μl/孔洗涤液(1×PBS)冲洗孔三次

14.通过轻弹去除洗涤液

15.加入100μl/孔底物溶液，并在15-25℃下孵育30分钟

16.测量370nm处的吸光度(参考波长：492nm)

实施例5

进行基于FACS的细胞增殖测定以确定HS8对hMSC增殖的影响(下文描述方案)。

6天内用Guava ViaCount(基于FACS)法监测人间充质干细胞对HS8(HS8+)的剂量反应。FGF2用作给药阳性对照。HS8被发现增强hMSC增殖并提供了显著的刺激。

细胞增殖方案

材料

1.HM20hMSC-男性西班牙裔20岁供体(从隆萨-Lonza购买)

2.FGF 2(R D系统。目录号233-FB-025)

3.维持培养基：DMEM(10mg/l葡萄糖)，10％FCS，1％Pen/Strp，2mM L-谷氨酰胺

4.HS8(+)批次2，HS8(-)批次2，猪粘膜硫酸乙酰肝素(Celsus实验室，美国)，肝素(Sigma目录号H3149)

5.番石榴弗莱(Flex)试剂(密理博-Millipore)

方法

1.将HM20细胞接种24孔板上(第0天)，500μl/孔培养基中3000细胞/cm2的密度

2.第1天-更换培养基，含增加浓度的FGF2(ng/ml)和GAG(μg/ml)–500μl新鲜培养基中10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156

3.每2天更换培养基

4.在指定时间点(第2天，第4天和第6天)用100μl胰蛋白酶消化收集细胞并用100μl培养基(t＝第2天)或300μl培养基(第4和6天)中和

5.在番石榴机(Guava machine)(番石榴弗莱试剂：细胞悬浮液为1:200)中计数细胞。

实施例6-人间充质干细胞分离

人骨髓(BM)单核细胞的制备

通过密度梯度分离收集人骨髓(BM)和制备BM单核细胞

1.经知情同意，从健康的年轻志愿者(18-40岁)通过从髂后嵴(髋骨)抽吸收集约40mL人骨髓(BM)。将BM立即放入无防腐剂的含肝素钠的50mL管(10,000单位/管)中。

2.除去10-μl等分试样，并将其1:20稀释到白细胞液(WCF)中，并用血细胞计数器计数成核细胞含量。

3.然后将等体积的封闭缓冲液加入到BM抽吸物中，充分混合，然后通过70-μm Falcon细胞过滤器应变以除去任何小的凝块和骨碎片。

4.然后将3ml Ficoll-Hypaque(Lymphoprep)溶液分配到约12圆底14-mL聚苯乙烯Falcon试管的底部，用7.5mL稀释BM小心层叠其上。

5.试管在室温下以400g离心30分钟。

6.利用一次性塑料巴斯德移液器从所有试管回收白细胞带，合并入4X 14mL聚丙烯试管。

7.用HHF洗涤缓冲液稀释细胞，在4℃以400g离心样品10分钟以沉淀BMMNC。

8.吸出缓冲液，将细胞合并在一个试管中。

通过贴壁分离MSC

1.将BMNC级分接种入15cm平皿的维持培养基中(DMEM,1g/l葡萄糖,10％FCS,2mM L-谷氨酰胺,50U/ml青霉素和50U/ml链霉素)，细胞贴壁3天，然后作第一次培养基更换。

2.将细胞培养在维持培养基中，每3-4天更换培养基，利用0.125％胰蛋白酶作常规传代直至85％汇合。再涂布，将细胞以3,000/cm2接种。所有培养物维持在37℃、5％CO2的加湿孵育箱中。

3.利用无酶细胞解离溶液(美国医学仪器公司的细胞剥离器-CellStripper,Mediatech,USA)从培养物中分离细胞，用PBS洗涤一次，再计数。然后将1x 105个细胞等份加入96-孔板，450x g离心5分钟以沉淀细胞。然后加入2％FCS/PBS预稀释的免疫表型检测抗体溶液，在冰上温育细胞20分钟。然后用2％FCS/PBS洗涤细胞两次，再重悬于2％FCS/PBS中，用GUAVA PCA-96台式流式细胞仪(美国瓜瓦技术公司-Guava Technologies Inc.)分析。所有的样品一式三份检测。

STRO-1阳性BMSSC的磁性激活细胞分选(MACS)

采用MACS能部分纯化BMSSC群体以及加工大量的BMMNC而不影响整体干细胞收率。按照密度梯度离心，从40mL BM抽吸物中回收约1-2×108个单个核细胞。免疫标记前，将BMMNC悬于0.5mL封闭缓冲液并在冰上温育约30分钟，以降低Fc受体-介导的抗体结合的可能性。

采用磁性激活细胞分选(MACS)分离STRO-1+BMSSC

1. 4℃下，通过400g离心10分钟以沉淀BMMNC，以500μl STRO-1上清液每5×107个BMMNC重悬，冰上温育60分钟，并作偶尔的轻柔混合。

2.BMMNC用HHF洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于含有生物素化山羊抗小鼠IgM(μ-链特异性)的0.5mL HHF中作1/50稀释，在4℃温育45分钟。

3.用MACS缓冲液洗涤BMMNC三次，重悬于其中加入50μL链霉亲和素微珠(10μL微珠/107个细胞，90μL MACS缓冲液中)的450μL MACS缓冲液。将混合物在冰上温育15分钟。

4.用冰冷却的MACS缓冲液洗涤一次后，取小等分试样的细胞作流式细胞术分析(预取样)。然后将剩余的细胞置于mini MACS柱(柱容量为108个细胞，美天旎生物技术公司，MS柱)。所述STRO-1-细胞(阴性级分)未保留在柱内并在重力作用下流过柱，进入流出物，收集在新的2ml聚丙烯试管中，而STRO-1+细胞保持连接于磁化基质。

5.用0.5mL MAC缓冲液洗涤柱3次，以除去任何非特异性结合的STRO-1-细胞，其收集在新的2毫升聚丙烯试管中。

6.将柱从磁场取出后，用MACS缓冲液冲洗柱，从而将STRO-1+细胞(阳性级分)回收到新的2毫升聚丙烯试管。然后计数STRO-1+细胞并作处理以便用于双色FACS。

7.取预-MACS、STRO-1-和STRO-1+各级分的小样品(0.5-1.0x 105个细胞)，置于含0.2ml链霉亲和素-FITC偶联物的不同2mL聚丙烯试管中(1/50)。然后将细胞样品在冰上温育5分钟，以评估富集过程。未标记的预-MACS细胞的样品(1.0x 105个细胞)作为阴性对照。

8.这些样品用HHF洗涤两次，用FACS Fix溶液固定，随后通过流式细胞术分析，以评估纯度和回收率。

9.此时，部分纯化的STRO-1+BMSSC可以培养扩增或通过双色FACS作进一步纯化。

通过集落效率测定评估骨髓质量

人骨髓抽吸物中CFU-F集落的预期发生率是每涂布的105个细胞约5-10个CFU-F。

1.将BMMNC以0.3、1.0和3.0x 105个细胞每孔接种在6-孔培养板中补充有20％(v/v)FBS,2mM l-谷氨酰胺,100μM l-抗坏血酸-2-磷酸酯,50U/mL青霉素,50mg/mL链霉素和β-巯基乙醇(5x 10-5M)的α-MEM中。培养物为一式三份，在37℃、5％CO2和 90％湿度下温育12天。

2.用PBS洗涤第12天的培养物两次，然后在PBS配制的1％(w/v)低聚甲醛中固定20分钟。

3.然后用0.1％(w/v)甲苯胺蓝(1％低聚甲醛溶液配制)染色固定的培养物1小时，再用自来水冲洗并使其干燥。超过50个细胞的聚集体评定为CFU-F。

高度纯化BMSSC的荧光激活细胞分选

虽然所有可检测的CFU-F包含在STRO-1+BMMNC级分内，BMSSC仅占总STRO-1+群体的不到2％。大多数STRO-1+细胞是血型糖蛋白-A+有核红细胞，一些是CD19+B-细胞。因此，基于STRO-1表达的BMSSC选择仅获得部分富集CFU-F(约10倍)的结果。克隆源性BMSSC均包含在STRO-1亮细胞级分中，该级分通过基于标志物表达的双色FACS可以进一步判别，所述标志物不存在于有核红细胞和淋巴细胞上，特别是CD106和CD146。下述方法能分离总STRO-1+细胞级分中的较小亚群，STRO-1亮/CD106+BMMSC(1.4％±0.3；n＝20)，其中涂布的每2-3个细胞中有1个具有形成CFU-F的性能。该富集水平几乎比未分级BMMNC观察到的CFU-F的平均发生率(涂布的每10,000个细胞有1个CFU-F)高5,000-倍。

采用流式细胞术细胞分选(FACS)分离STRO-1亮/CD 106+BMSSC

1.免疫标记前，将MACS-分离的STRO-1+细胞BMMNC(一般是1x 108个BMMNC中2-5x 106个细胞)重悬于0.5mL HHF，以为2-色免疫荧光和FACS作准备。

2.约3-5x 105个MACS-分离的STRO-1+细胞分散入3个适当标记的试管，向其中加入以下物质：

(i)无一抗(双阴性对照)，维持于冰上。

(ii)链霉亲和素-FITC偶联物(1/100稀释，HFF配制)在冰上温育30分钟(FITC对照)。然后用HHF洗涤细胞两次。

(iii)0.5mL鼠科IgG抗人CD106(VCAM-1)用HFF稀释至20μg/ml。STRO-1+细胞在冰上温育30分钟，用HHF洗涤两次，重悬于0.2mL PE-偶联的山羊抗-小鼠IgG(γ-链特异性),(PE对照)。样品经温育和洗涤，然后重悬于HFF。

(iv)其余的1-2x 106个MACS-分离的STRO-1+细胞重悬在0.5mL鼠科IgG抗-人CD106(VCAM-1)并如上所述温育，用HHF洗涤两次，重悬于0.2mL PE-偶联的山羊抗-小鼠IgG(γ-链特异性)和链霉亲和素-FITC偶联物(1/100稀释度，HHF配制)，然后在冰上温育30分钟(分选样品)。之后如上述那样洗涤这些细胞，并重悬于HHF中。

3.将样品以每毫升1x107个细胞的浓度重悬在HHF中，然后利用配有波长为488nm的250MW氩激光发射光的任何分选仪作分选，从而能同时检测FITC和PE。

样品(i-iii)用于补偿FITC和PE。

5.将样品(iv)的经分选STRO-1亮/VCAM-1+细胞收集在含有合适生长培养基的试管中并混合。

6.如上所述进行细胞计数。然后培养分选的细胞。

人BMSSC的离体培养

含血清培养基

1.在37℃、4％CO2和 90％的相对湿度下，将STRO-1亮/CD 106+分离的BMSSC群体(1-3x 104/cm2)在含有Eagle培养基的α-改进(α-MEM)的组织培养烧瓶或平板中培养2周，所述培养基补充了20％胎牛血清、100μM l-抗坏血酸-2-磷酸酯、2mM l-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素。当培养物达到80-90％汇合时，原始BMSSC群体传代。

2.用无血清HBSS洗涤贴壁培养物一次，通过在每个T75烧瓶中加入2mL 0.5％胰蛋白酶/EDTA溶液，37℃温育5-10分钟进行酶促消化以解离细胞。

3.通过在0.4％台盼蓝/PBS中制备单细胞悬液的1:5稀释液来评估细胞活力，采用血细胞计数器测定活细胞数。

4.合并BMMSC单细胞悬液，以0.5-1.0x 104/cm2再接种在补充了10％FBS、100μM l-抗坏血酸-2-磷酸酯、2mM l-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的α-MEM生长培养基中，在37℃、5％CO2和 90％相对湿度下温育。通过抽出培养基并用升温至37℃的等体积的新鲜制备培养基替换来对培养物补料。

血清消除培养基

该方法是最初为培养造血组细胞开发的血清消除培养基(SDM)的改进。

1.通过在室温下用纤连蛋白溶液以5μg/cm2预包被90分钟来制备纤连蛋白包被的板或烧瓶。此后，纤连蛋白溶液吸出并用无菌PBS洗涤培养容器一次，然后接种细胞。

2.STRO-1亮/CD106+分离的BMSSC群体(1-3x 104/cm2)悬浮在培养基中，从而培养在纤连蛋白包被的组织培养瓶或板中，所述培养基含有补充了2％(w/v)牛血清白蛋白(Cohn fraction V)、10μg/mL重组人胰岛素、人低密度脂蛋白、200μg/mL铁饱和的人转铁蛋白、2mM l-谷氨酰胺、地塞米松磷酸钠(10-8M)、100μM l-抗坏血酸-2-磷酸酯、β-巯基乙醇(5x 10-5M)、10ng/mL血细胞衍生的生长因子-BB、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的α-MEM。

3.然后将培养物在37℃、4％CO2和 90％相对湿度下温育2周。当培养物达到80-90％汇合时，原始BMSSC群体传代。

离体扩增的MSC的冷冻保存

1.一般通过上述的胰蛋白酶/EDTA消化来制备，培养扩增的MPC的单细胞悬液。然后用冷HFF稀释并洗涤细胞。

2.将细胞沉淀物以1x 107个细胞每毫升FBS的浓度重悬，并保持在冰上。然后逐渐加入等体积的冷冻混合物(20％DMSO，冷FBS配制)，同时轻轻混合细胞，在10％DMSO/FBS中得到最终浓度为每毫升5×106个细胞。1ml等分试样再分装入在冰上预冷的1.8-ml冷冻管，然后利用控速冷柜以-1℃每分钟的速率冷冻。

3.然后将冷冻的小瓶转移到液氮中长期贮存。将细胞37℃水浴中迅速解冻恢复冻结的储备物。然后将细胞重悬于冷的HFF并以280g离心10分钟。

4.为评估细胞活力，在0.4％台盼蓝/PBS中制备1:5稀释液，并且使用血细胞计数器测定细胞数。通常，此过程得到80-90％的活力。

实施例7-集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)测定

采用下述方法评估hMSC的CFU-F特性。将hMSC在未作补充的对照培养基之一中培养4代，然后在未作补充的对照培养基之一或添加以下之一的对照培养基中培养：肝素(1.25μg/ml)、Celsus HS(1.25μg/ml)、HS8-(1.25μg/ml)、HS8(HS8+)(1.25μg/ml)或HS8(HS8+)(2.5μg/ml)。结果示于图24A和24B。

材料

1.hMSC-(购自隆萨公司)。

2.维持培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺。

3. 100％甲醇配制的结晶紫0.5％。

方法

1.将MSC以150个细胞/cm2一式三份涂布在100x 15mm培养皿中，10ml培养基/皿。

2.细胞培养14天，在第7天更换培养基。

3.在第14天，如下所示用结晶紫(0.5％，100％甲醇配制)染色平板：

a.去除培养基并用PBS洗涤两次

b.加入10ml/皿的结晶紫，并温育30分钟

c.用PBS洗涤一次，用H2O洗涤一次并干燥平板

d.计数含超过50个细胞并且不与其它集落接触的集落。

实施例8-MSC的多能特征

按照下述方法，通过检验MSC分化成骨(成骨作用)和脂肪(脂肪生成作用)的能力测试MSC的多能特征。结果示于图25。

细胞

4代细胞(P4)–普通维持培养基中培养的hMSC

7代细胞(P7)–含有以下处理试剂之一的普通维持培养基中培养的P4到P7的hMSC：

·HS8(HS8(+))2.5ug/mL

·HS8(-)1.25ug/mL

·Celsus HS 1.25ug/mL

·肝素 1.25ug/mL

·FGF2 1.25ug/mL

成骨分化

材料

1.hMSC-(购自隆萨公司)。

2.维持培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺

3.处理维持培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,10nM地塞米松,10mMβ-甘油-磷酸酯和25μg/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯

4.PBS配制的4％低聚甲醛

5.茜素红溶液：1.37g，100mL H2O配制；pH 4.1-4.3

方法

1.将细胞接种(3,000个细胞/cm2)在6-孔板中，24小时。

2.对照孔的培养基更换为维持培养基

3.处理孔的培养基更换为含有10nM地塞米松、10mMβ-甘油-磷酸酯和25μg/ml L-抗坏血酸-2-磷酸酯的维持培养基

4.然后培养所有的细胞28天，每3天更换培养基

5.然后用茜素红染色细胞：

a.用PBS洗涤3次

b.用4％低聚甲醛固定细胞10分钟

c.用ddH2O洗涤3次

d.向细胞中加入茜素红溶液，温育30分钟，缓慢振荡

e.用ddH2O洗涤3次

f.空气干燥染色的细胞

成脂分化

材料

1.hMSC-(购自隆萨公司)。

2.脂肪细胞维持培养基：DMEM(4500mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺

3.脂肪细胞处理培养基：DMEM(4500mg/L葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,10μM地塞米松,10μM胰岛素,20μM吲哚美辛和115μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤

4.PBS配制的4％低聚甲醛

5.油红O溶液：0.36％，60％异丙醇配制

方法

1.将细胞接种(18,000个细胞/cm2)在6-孔板中，一式三份

2.将细胞培养至汇合

3.对照孔的培养基更换为脂肪细胞维持培养基(4500mg/L葡萄糖)

4.处理孔的培养基更换为含有1μM地塞米松,10μM胰岛素,20μM吲哚美辛和115μg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的脂肪细胞处理培养基

5.然后培养28天，每3天更换培养基

6.然后用油红O染色细胞：

a.用PBS洗涤3次

b.用4％低聚甲醛固定细胞60分钟

c.用ddH2O洗涤1次

d.向细胞中加入油红O溶液，温育1小时，缓慢振荡

e.用60％异丙醇洗涤2次

f.用ddH2O洗涤3-5次

g.除去板上的ddH2O或空气干燥染色的细胞

实施例9

采用下述方法研究HS8对FGF-2介导的hMSC生长的影响。发现HS8能增强FGF-2介导的MSC生长(图26)。

细胞

4代细胞–在含和不含以下处理试剂之一的普通维持培养基中培养的hMSC：

·仅含FGF2 0.156ng/mL

·FGF2 0.156ng/mL与不同剂量的HS8(+)

细胞增殖方案

材料

1.hMSC-(购自隆萨公司)。

2.FGF 2(RD系统公司目录号233-FB-025)。

3.维持培养基：DMEM(1000mg/l葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺。

4.HS8(HS8(+)),HS8(-),猪粘膜硫酸乙酰肝素(塞尔萨斯试验室有限公司,美国),肝素(西格玛目录号H3149)。

5.Guava Flex试剂(密理博公司)。

方法

1.将细胞以500μl/孔培养基、3,000个细胞/cm2接种在24-孔板中(第0天)

2.第1天–培养基更换为含有维持培养基加单独的FGF2(0.156ng/mL)或FGF2(0.156ng/mL)与各种浓度的HS8(+)：10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156(μg/ml)，500μl新鲜培养基中

3.每2天更换培养基

4.在第4天用100μl胰蛋白酶处理收集细胞，用300μl培养基中和

5.用GUAVA仪器(Guava flex试剂:细胞悬液为1:200)计数细胞。

实施例10

采用下述方法研究HS8对经由ERK途径的FGF-2信号传导的影响。通过ERK1/2和FRS2a的磷酸化检测发现HS8能增强/维持FGF2介导的ERK途径信号传导(图27)。

细胞

P4–在含和不含以下处理试剂的普通维持培养基中培养hMSC：

·仅含FGF2 0.312ng/mL

·HS8(HS8(+))2.5μg/mL

蛋白质印迹

材料

1.hMSC-(购自隆萨公司)。

2.FGF 2(RD系统公司目录号233-FB-025)。

3.维持培养基：DMEM(1000mg/l葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺。

4.无血清培养基：DMEM(1000mg/L葡萄糖),0.2％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺

5.针对磷酸-FRS2a的抗体(细胞信号传导公司-Cell Signaling.目录号3861)1:1000，TBST配制的5％BSA

6.针对磷酸-ERK1/2的抗体(细胞信号传导公司目录号9106L)1:2000，TBST配制的5％BSA

7.针对总ERK1/2的抗体(细胞信号传导公司目录号9102L)1:1000，TBST配制的5％BSA

8.针对肌动蛋白的抗体(密理博化学公司-Millipore Chemicon.目录号MAB1501R)1:8000，TBST配制的5％BSA

方法

1.将细胞以10,000个细胞/cm2接种在6-孔板的维持培养基中

2.第1天：将培养基更换为无血清培养基，2mL/孔

3.第3天：将处理试剂加入孔中。所需量的HS8(+)和/或FGF2在无-血清培养基中给予，以10μL/孔加入

4.在不同时间点(30分钟和24小时)，用1.5X laemmli缓冲液收集细胞，100μL/孔

5.裂解物在95℃加热5分钟，保存在-20℃

6.样品经冻融一次

7.将20μL/孔的样品加载入Novex 4-12％Bis-Tris SDS PAGE凝胶的各道，10孔(英杰公司.目录号NP0335BOX)

8.在180V，利用1X MOPS缓冲液跑凝胶50分钟

9.然后在100V，1X转移缓冲液中将分辨的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜，1小时30分钟

10.用Ponceau S溶液染色硝酸纤维素膜，根据感兴趣蛋白质的大小切成条带

11.然后在室温下，用TBST配制的5％BSA或5％脱脂奶封闭膜30分钟到1小时并缓慢振荡

12.然后将推荐稀释度的一抗在4℃温育过夜并缓慢振荡

13.然后用TBST洗涤印迹3次，每次5分钟

14.然后将推荐稀释度的二抗在室温下温育1小时至两小时并缓慢振荡

15.然后用TBST洗涤印迹3次，每次5分钟

16.印迹与化学发光试剂温育并在暗室处理使得x-射线薄膜显色以供目测观察条带

实施例11-HS8的NMR分析

分析前，将HS8的样品保存在-20℃。通过溶解于含有内标tBuOH(200μL,δ1.24ppm)的D2O(600uL)完成NMR分析，该内标用于化学位移比较和定量测定。精确称重约1、4和7mg量的Celsus HS，制成工作D2O/tBuOH溶液，在与HS8相同的运行中分析。标准溶液的拟合线得到回归为0.995或更好以便相比于内标，积分乙酰基甲基区域，δ3.15-3.25ppm的区域和异头区域δ5.15-5.65ppm的最低场部分。

样品的小尺寸导致低信噪比，因此，仅有乙酰基区域数据用于计算递送0.7mg值的HS8量。完成第二实验，比较乙酰基峰的信噪比，记录0.5mg的值。这是与内标无关的绝对值。在进一步分析之前通过3个冻干步骤除去tBuOH，记录的质量是1.2mg。值得注意的是，可积分SEC HPLC数据以便得到大致的纯度值，其也记录到58％，提示材料中存在0.7mg HS-GAG。此类质量差异在小GAG样品中不是什么新的现象，因此，估计改变湿度和盐的比例肯定影响记录的质量。

HS8、Celsus HS和HS3*的1H NMR图谱显示于图31。所示图中相比于其它信号(Celsus HS在4.8-4.9有最高峰，HS3是中等高度峰)的HS8强度差异(在4.8-4.6ppm有最低峰)是因为所有图谱根据乙酰基甲基共振的高度标准化：就该HS8样品而言，观察到略好的匀场，其中线宽较窄，从而导致乙酰基共振较尖锐和较高。

通过2-D NMR区分HS8相比于Celsus HS的组成改变。

密切检查HS8 1H NMR的次甲基和亚甲基区域显示相比于Celsus HS和HS3的差异(图32)。

[*HS3是对BMP-2的乙酰肝素结合域具有特异性和高结合亲和力的分离的硫酸乙酰肝素。HS3描述于WO2010/030244]

实施例12-HS8和其它HS制品的HPLC-SEC-RI

用水制成2mg/mL的硫酸乙酰肝素制品(约1mg，精确称重)。这些制品在水中的肝素裂合酶I、II和III消化物是2mg/ml。溶液经离心(14 000g,2min)，取200μL等份试样作分析。

SEC-RI系统由Waters 2690Alliance分离模块和Water 2410折射率监视器(范围64)构成。从RI色谱图进行定量的dn/dc设定为0.129(参比)。注射样品(50μL)，用50mM乙酸铵，以0.5ml/分钟从串联的两根SuperdexTM肽10/300GL柱(300x 10mm GE保健公司-GE Healthcare,白金汉郡,英国)洗脱。利用ASTRA software(4.73.04版,雅特技术公司-Wyatt Technology Corp)收集数据和分析。

全HS8制品的尺寸-排阻层析显示不同的尺寸排阻图。Celsus HS起始材料在15mL显示空信号(voiding signal)，其余各种尺寸的材料在约23mL洗脱剂时洗脱。如图33所示，HS8材料(FGF-2亲和柱保留)显示富集在排空SEC柱的物质中的尺寸图。

这再次与于HS3制品的尺寸图不同，从而显示HS8和Celsus HS图之间的中等尺寸图(图34)。HS8色谱图在约36mL显示大的盐信号，因为该样品在50mM乙酸钠缓冲液(pH 7)而非水中制备。

图35显示Celsus的两个不同批次的HS的SEC色谱图。第10697批用作起始材料以便制备HS3和HS8。用酶对两批次的消化是相似的，除了第10595批看起来根本未消化的和排空柱的物质量较大。

HS8的肝素裂合酶消化物的尺寸图(图36)与Celsus HS起始材料(图35)或HS3(图36)的极为不同。HS3所得的尺寸图与以前的消化物所得的非常类似。与HS3消化物的类似，HS8色谱图在排空体积(15mL)几乎不显示强度，提示大多数材料消化到相同的程度。然而，两种HS3消化物在约19mL显示显著不同的信号强度，而HS8在约18mL显示较宽的信号。

实施例13-[3H]肝素试验

采用下述方案评估源自FGF2的氨基酸序列的SEQ ID NO:1的肝素结合能力。结果示于图37。

材料

(1)肽：

Gandhi等(HS8)–南洋理工大学(Nanyang Technological University)制备

GHFKDPKRLYCKNGGF-Ahx-(K)生物素

(2)3H肝素 0.1μCi(珀金埃尔默公司-Perkin Elmer,波士顿,美国)

(3)硝酸纤维素膜(伯乐公司-Bio-Rad,美国)

(4)牛血清白蛋白4％(w/v)，PBS配制

(5)真空电炉(TF科技公司-Thermo Fisher Scientific,美国)

(6)Tri-Carb 2800TCR液体闪烁分析仪(珀金埃尔默公司,波士顿,美国)

方法

(1)用PBS补足FGF2-HBD-肽至所需浓度(4.66x10-9,9.32x10-9,1.86x10-8,3.73x10-8摩尔)

(2)用已知浓度的肽一式两份浸渍相同的硝酸纤维素膜

(3)空气干燥膜1h

(4)在80℃用真空电炉进一步干燥45分钟

(5)用PBS洗涤膜3次

(6)将3H肝素0.1μCi加入膜，在闪烁计数小瓶中温育16小时

(7)用PBS洗涤膜4次

(8)用Tri-Carb 2800TCR液体闪烁分析仪(珀金埃尔默公司,波士顿,美国)测定放射性。

实施例14

采用下述方案评估肝素结合域肽SEQ ID NO:1结合固定化肝素的能力。结果示于图38。

材料

1.标准试验缓冲液(SAB)–100mM NaCl,50mM乙酸钠,0.2％v/v吐温20,pH7.2

2.封闭缓冲液-0.4％鱼明胶(西格玛目录号67041)+SAB

3.GAG结合板(艾度仑,英国)

4.肽：

Gandhi等(HS8)-南洋理工大学制备

GHFKDPKRLYCKNGGF-Ahx-(K)生物素

5.ExtraAvidin-AP(Sigma目录号E2636)

6.Sigma FAST对-硝基苯基磷酸酯(西格玛,N2770)

方法

1.将肝素溶解于SAB(5μg/ml)

2.将200μl肝素溶液/孔加入GAG结合板，室温下避光温育过夜

3.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

4. 37℃下用250μl/孔封闭缓冲液避光温育平板1小时

5.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

6.将肽溶解于封闭缓冲液，并进行连续稀释：0、50、100、200nM

7.将200μl/孔的稀释蛋白分配入GAG包被平板，在37℃温育2小时

8.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

9.加入200μl/孔的封闭溶液配制的220ng/ml ExtraAvidin-AP，并在37℃下温育30分钟

10.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

11.加入200μl/孔的显色剂：DI水配制的Sigma FAST对-硝基苯基磷酸酯，室温下温育40分钟

12.读取405nm的吸光度

实施例15

评估FGF-2结合HS8的能力。这与和原始HS的结合(HS-PM猪粘膜)，或无糖情况相比较。结果示于图39。

材料

1.标准试验缓冲液(SAB)–100mM NaCl,50mM乙酸钠,0.2％v/v吐温20,pH7.2

2.封闭缓冲液-0.4％鱼明胶(西格玛目录号67041)+SAB

3.GAG结合板(艾度仑,英国)

4.RD系统公司的蛋白：FGF 2-233FB

5.RD系统公司的抗体：FGF 2-BAM233

6.ExtraAvidin-AP(西格玛目录号E2636)

7.Sigma FAST对-硝基苯基磷酸酯(西格玛,N2770)

方法

1.将GAG溶解于SAB(5μg/ml)

2.将200μl GAG溶液/孔加入GAG结合板，室温下避光温育过夜

3.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

4. 37℃下用250μl/孔封闭缓冲液避光温育平板1小时

5.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

6.将蛋白溶解于封闭缓冲液，并进行连续稀释：0、0.781、1.56、3.125nM

7.将200μl/孔的稀释蛋白分配入GAG包被平板，在37℃温育2小时

8.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

9.加入200μl/孔的封闭溶液配制的250ng/ml生物素化一抗，并在37℃下温育1小时

10.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

11.加入200μl/孔的封闭溶液配制的220ng/ml ExtraAvidin-AP，并在37℃下温育30分钟

12.用SAB以250μl/孔小心洗涤平板3次

13.加入200μl/孔的显色剂：DI水配制的Sigma FAST对-硝基苯基磷酸酯，室温下温育40分钟

14.读取405nm的吸光度。

实施例16

分析在有HS8存在下，塑料贴壁间充质干细胞在6天期间的增殖情况。结果示于图40。

细胞增殖方案

材料

1.HM20hMSC–20岁西班牙裔男性捐赠者(购自隆萨公司)

2.FGF 2(RD系统公司目录号233-FB-025)

3.维持培养基：DMEM(1000mg/l葡萄糖),10％FCS,1％青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺

4.HS8

5.Guava Flex试剂(密理博公司)

方法

1.将HM20细胞以3000个细胞/cm2、500μl/孔培养基涂布在24-孔板上(第0天)

2.第1天–更换培养基，GAG(μg/ml)–2.5和0.5

3.每2天更换培养基

4.在指定的时间点收集细胞(第6天)–用100μl胰蛋白酶并用300μl培养基中和

5.用Guava仪器(Guava flex试剂:细胞悬液为1:200)计数细胞

实施例17

与原始Celsus起始HS(HS-PM)或非-结合性HS流出物(HS8-)相比，通过如下所述的BrDU掺入检测在有分离的HS8存在下，STRO-1-分离的间充质干细胞在36小时期间的增殖情况。结果示于图41(其中HS8G＝HS8)。

方案(细胞增殖ELISA，BrdU(比色法)罗氏公司)

1.细胞接种-每孔在190μl培养基中的5000个细胞(96孔板)

2.培养基–αMEM+10％胎牛血清(FCS)+1％L-谷氨酰胺+1％青霉素和链霉素+100nM L-谷氨酸

3. 37℃和5％CO2下温育6小时

4.温育6小时后，按照计划，为指定的孔加入10μl培养基配制的不同剂量处理试剂

5.GAGs(μg/ml)–10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125

6. 37℃和5％CO2下用处理试剂温育36小时

7.将BrdU加入各孔

8. 37℃和5％CO2下，用BrdU标记细胞2小时(加入20μl BrdU标记溶液/孔)

9.扣干平板以除去标记培养基

10.将200μl/孔FixDenat加入细胞，并在15-25℃温育30分钟

11.通过轻弹和扣干彻底除去FixDenat溶液

12.加入100μl/孔抗-BrdU-POD工作溶液，15-25℃温育90分钟

13.通过轻弹和用250μl/孔洗涤溶液(1x PBS)洗涤3次除去抗体偶联物

14.通过扣干除去洗涤溶液

15.加入100μl/孔底物溶液，在15-25℃温育30分钟

16.检测370nm的吸光度(参比波长：492nm)

实施例18-二糖的毛细管电泳(CE)分析

硫酸乙酰肝素(HS)来自塞尔萨斯试验室有限公司(HO-03103,批号HO-10697)。利用细菌肝素酶消化高级别猪肝素得到的二糖(ΔUA,2S–GlcNS,6S；ΔUA,2S–GlcNS,ΔUA,2S–GlcNAc,6S,ΔUA–GlcNS,6S,ΔUA–GlcNS,UA–GlcNAc,ΔUA,2S–GlcNAc,ΔUA–GlcNAc,6S,ΔUA,2S–GlcN,ΔUA,2S–GlcN,6S,ΔUA–GlcN,6S,ΔUA–GlcN目录号HD001到HD013,艾度仑有限公司-Iduron Ltd,曼彻斯特,英国)购自英国曼彻斯特艾度仑有限公司。非天然产生的二硫酸化二糖的合成衍生物(ΔUA,2S-GlcNCOEt,6S)也购自艾度仑有限公司以便用作内标。肝素寡糖(dp4,dp6,dp8,dp10,dp12(目录号HO04,HO06,HO08,HO10,HO12))和选择性脱硫酸化的肝素标准品(2-O,6-O和N-脱硫酸化肝素)(目录号DSH001/2,DSH002/6,DSH003/N,艾度仑有限公司,曼彻斯特,英国)也购自英国曼彻斯特的艾度仑有限公司。

肝素裂合酶I(乙酰肝素酶-Heparitinase,EC 4.2.2.8,也称为乙酰肝素酶I)、肝素裂合酶II(乙酰肝素酶II,未指定EC编号)和肝素裂合酶III(肝素酶,EC 4.2.2.7,也称为乙酰肝素酶III)获自日本生化学株式会社(Seikagaku Corporation)。将以冻干粉末(0.1U/小瓶)提供的这些酶溶解于0.1％BSA以提供含有0.5mU/μL的溶液。将等份试样(5μL；2.5mU)冷冻(-80℃)备用。

用肝素裂合酶消化HS制品

将各HS制品(1mg)溶解于500μL乙酸钠缓冲液(100mM含有10mM乙酸钙,pH7.0)，加入2.5mU的各3种酶。将样品在37℃温育过夜(24小时)并轻柔颠倒(9rpm)试管。再将2.5mU的各3种酶加入样品，在37℃再温育48小时并轻柔颠倒(9rpm)试管。通过加热(100℃，5分钟)来停止消化，然后冻干。将消化物重悬于500μL水中，取等份试样(50μL)用于CE分析。

毛细管电泳(CE)

将20mM H3PO4的水性溶液加入20mM Na2HPO4.12H2O的溶液得到pH 3.5，从而制备毛细管电泳操作缓冲液。柱洗涤液是100mM NaOH(从50％w/w NaOH稀释)。利用配有0.2μm醋酸纤维素滤膜(47mmSS公司-Schleicher and Schuell,达瑟尔,德国)的密理博过滤单元过滤操作缓冲液和柱洗涤液。

将二糖溶解于水中(1mg/mL)来制备12种二糖标准品的储备液。为测定标准品的校准曲线，制备含有12种标准品的混合物。12种标准品混合物的储备溶液含有10μg/100μL的各二糖，并制备含有10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/100μL的连续稀释液；包含2.5μg内标(ΔUA,2S-GlcNCOEt,6S)。用水稀释HS的消化物(50μL/mL)，向各样品中加入相同的内标(2.5μg)。将溶液冻干并重悬在水(1mL)中。利用PTFE亲水性一次性注射器过滤单元(0.2μm；13mmAdvantec,TRK公司-Toyo Roshi Kaisha,Ltd.,日本)过滤样品。

25℃，利用20mM操作缓冲液和Agilent3DCE(安捷伦技术公司-Agilent Technologies,瓦尔特布隆,德国)仪器，在未涂覆的熔融石英毛细管(75μm ID,64.5cm总长和56cm有效长度,聚微技术公司-Polymicro Technologies,菲尼克斯,亚利桑那州,零件号TSP075375)上进行分析，毛细管电压为30kV。采用水力注射(50mbar x12sec)将样品引入毛细管的阴极(负极)端。

每次运行之前，用100mM NaOH(2分钟)、水(2分钟)冲洗毛细管，并用操作缓冲液预条件化(5分钟)。缓冲液补充系统替换入口管和出口管中的缓冲液以确保维持一致的体积、pH和离子强度。水在样品序列的开始、中段和结束时仅作为空白运行。监测232nm的吸光度。所有的数据储存在ChemStore数据库中，随后利用ChemStation软件取回和再加工。

采用以上详述的条件分离标准品混合物中12种肝素二糖的11种。在这些实验所用的条件下，第12种二糖ΔUA-GlcN不迁移。然而，该二糖未报道见于硫酸乙酰肝素中。标准品校准曲线的R2值范围从0.9949到1.0。

一式两份制备HS制品的肝素裂合酶I、II和III消化物，将一式两份样品的每一份注射入CE两次。因此，HS消化物中二糖的标准化百分比是分析结果的平均值。在标准混合物中分离的11种二糖中，仅有8种是HS消化物中检测到。其它小的信号在消化物的电泳图谱的基线上发现，这些可能对应于 2dp的寡糖。如上所述，与二糖相比，较大的寡糖具有较低的UV吸光度。

基于Celsus HS(批号10697)的样品完成一式两份分析，并与同一样品以前的一组分析作比较：这些结果示于图42。观察两组分析之间优异的相关性。Celsus HS消化物中8种二糖的比例类似于大组分ΔUA-GlcNAc和ΔUA-GlcNS以及较小比例的ΔUA-GlcNAc,6S、ΔUA-GlcNS,6S和ΔUA,2S-GlcNS,6S的其它以前分析(图42)。这对应于大比例的单-硫酸化和未硫酸化二糖，比例低一些的二硫酸化二糖和小比例的三硫酸化二糖，与HPLC-SEC图谱相一致。相比于Celsus HS起始材料，未保留的HS富集在单-硫酸化和未硫酸化二糖中。在HPLC-SEC色谱图中也发现未保留物质的这种模式是极为不同的。就HS8的分析而言，样品大小仅能进行单次分析，因此该制品未提供误差数据。HS8、HS3和Celsus HS的比较示于图44。

HS8的二糖组成与HS3(通过与BMP2的肝素结合域的亲和力从Celsus HS分离的HS，如WO2010/030244所述)的相当，其中整体上从Celsus HS制备了更高硫酸化(荷电)的级分。然而，明显的不同在于相比于HS3，HS8的UA-GlcNS,6s比例更高，US-GlcNS的比例较低。

获得HS8的原料Celsus HS的平均分子量为20-25kDa(相比之下，肝素约15kDa)，通过亲和层析鉴定HS8的过程未导致观察到的HS链分子量有实质性改变。预计各二糖单位的分子量范围在约430到约650KDa。采用每个二糖500道尔顿的大致平均分子量(例如，肝素中二糖的平均分子量约为650道尔顿)表明(基本近似值)每个平均(22kDa)HS8的HS8链长约44个环。

实施例19

鉴定到HS8优先结合FGF2并增加hMSC生长率后，我们进一步研究了HS8活性的机制。

FGF2中和抗体或FGFR1抑制剂(均是激酶抑制剂和中和抗体)均能降低HS8在hMSC中的增殖效应(图47-50)，从而证实HS8在hMSC中的促有丝分裂作用是通过其与FGF2/FGFR而非其它分子相互作用产生的。有HS8存在下，FGF2的快速降解延迟(图46)，从而证实HS8与FGF2相互作用以免其从培养基中降解。

我们已经证明(上文)HS8增强hMSC自我-更新，同时维持多能性。为验证在hMSC常规培养基中补充HS8是否能更快扩增培养物，我们在补充了HS8的培养基中培养分别来自3位独立捐献者的hMSC。通过FACS检测3位捐献者的生物标志物CD14、19、34、45、HLA-DR、CD73、90、105、CD49a、SSEA-4和STRO-1(例如，图22)，我们注意到暴露于HS8的hMSC能形成更多的集落(图51)并维持干细胞-样表型，而无论额外的细胞倍增时间。

当hMSC在补充了HS8的培养基中扩增，表明\"干细胞特性”的生物标志物得以维持。

我们还发现这些细胞能方便地分化成所有3种间充质干细胞谱系(包括骨，如通过茜素红、Von Kossa、油红O和爱茜蓝染色测定的)并且具有增强的成骨作用，提示该策略可能对于矫型外伤治疗是有效的。HS8不负面影响MSC分化成骨的能力。

因此，我们将HS8施用于大鼠的头盖骨缺陷模型(图52)。改善的骨愈合明显提示HS8在外伤部位与FGF2相互作用，从而通过依赖于FGF-2的机制加速内源性干细胞和成骨祖细胞的活性，因而提高了该方法在治疗头盖骨缺陷中的治疗可能性。

实施例20-HS8对猪切除伤口模型的影响

猪皮肤伤口愈合方案

在五个成年小型猪的背面产生全层皮肤切割伤口。被麻醉的猪的背部被剃光并用聚维酮碘溶液清洗。为了用于第1、3、7、9、13和15天的实验时间点，使用6和10mm的活检穿孔器产生嵌套伤口。整个实验时间点需要一组三伤口。最初的三个伤口是用6毫米活检穿孔器制成。在第1、3和7天，每个伤口都将用10mm的活检穿孔器穿出。在第16天，10毫米伤口将用于第9、13和15天的时间点。

进行简单随机治疗，并且通过10mg/ml羧甲基纤维素(CMC)(西格玛)凝胶局部施用250μg uL HS化合物(n＝6)或单独的CMC凝胶(未处理的伤口)(n＝6)来开始治疗。在第0天和第1天，分别将56.5uL和157uL的化合物施用于6和10mm的伤口。伤口被Tegaderm敷料(3M，新加坡)覆盖。所有伤口均在手术后每周进行检查和拍照。

将猪在第16天进行安乐死，切除伤口的全层皮肤样品连同周围的未受伤皮肤并切成两半。将一半固定在10％中性缓冲福尔马林中进行组织学分析。将另一半放入TRIzol(生命科技)中并在-80℃下冷冻用于随后的分子分析。

最初可以使用6毫米穿孔器来检查伤口愈合的早期标记(例如炎症反应和再上皮化)，然后可以用更大的10mm穿孔器打出以寻找伤口愈合后来的标记(例如血管再生长，组织重组)。

图53显示了经过6mm穿孔程序的小型猪的侧面的总宏观视图。这些结果表明HS8在切除皮肤创伤的体内小型猪模型中增强伤口愈合。我们还经由实验确定HS8能够通过FGF-2依赖性途径触发真皮成纤维细胞的增殖。

作用机理是多重的。适合HS8皮肤/上皮伤口愈合的领域包括整形手术、结肠直肠吻合手术/缝合缝线、烧伤治疗、血管/动脉/压力性溃疡治疗、皮肤切口/创伤伤口修复、促进血管回到表皮隔层并刺激表皮干细胞功能后的愈合。主要作用是对FGF敏感细胞，特别是干细胞，对皮肤成纤维细胞和血管形成(血管发生)具有其他作用。

HS8能够增强FGF2，而不担心致癌结果。该糖增强皮肤中已天然表达的FGF-2。预期HS8本身具有重大的治疗作用，符合我们的实验结果。

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序列表

110 新加坡科技研究局

120 硫酸乙酰肝素用于皮肤修复和/或再生

130 RIC/FP7163835

150 SG 10201408007P

151 2014-11-19

160 15

170 PatentIn version 3.3

210 1

211 16

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 1

Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe

1 5 10 15

210 2

211 7

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 2

Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe

1 5

210 3

211 288

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 3

Met Val Gly Val Gly Gly Gly Asp Val Glu Asp Val Thr Pro Arg Pro

1 5 10 15

Gly Gly Cys Gln Ile Ser Gly Arg Gly Ala Arg Gly Cys Asn Gly Ile

20 25 30

Pro Gly Ala Ala Ala Trp Glu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Arg Pro Arg

35 40 45

Arg His Pro Ser Val Asn Pro Arg Ser Arg Ala Ala Gly Ser Pro Arg

50 55 60

Thr Arg Gly Arg Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Gly Ser Arg Leu Gly

65 70 75 80

Asp Arg Gly Arg Gly Arg Ala Leu Pro Gly Gly Arg Leu Gly Gly Arg

85 90 95

Gly Arg Gly Arg Ala Pro Glu Arg Val Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Pro

115 120 125

Gly Pro Ala Gly Thr Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala

130 135 140

Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys

145 150 155 160

Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile

165 170 175

His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His

180 185 190

Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys

195 200 205

Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu

210 215 220

Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu

225 230 235 240

Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp

245 250 255

Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr

260 265 270

Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser

275 280 285

210 4

211 7

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 4

Tyr Lys Arg Ser Arg Tyr Thr

1 5

210 5

211 7

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 5

Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr

1 5

210 6

211 17

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 6

Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys

210 7

211 18

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 7

Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly

1 5 10 15

Gln Lys

210 8

211 28

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 8

Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser

1 5 10 15

Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg

20 25

210 9

211 10

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 9

Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys

1 5 10

210 10

211 10

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 10

Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala

1 5 10

210 11

211 14

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 11

Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly

1 5 10

210 12

211 21

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 12

Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly

1 5 10 15

Gln Lys Ala Ile Leu

20

210 13

211 17

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 13

Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys

210 14

211 10

212 PRT

213 智人（Homo sapiens）

400 14

Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu

1 5 10

210 15

211 18

212 PRT

213 人工序列

220

223 合成肽

220

221 位置(SITE)

222 (17)..(17)

223 Xaa为Ahx

220

221 位置(SITE)

222 (18)..(18)

223 Lys为(K)生物素

400 15

Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe

1 5 10 15

Xaa Lys