褚福亮,王福生,中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室北京市100039项目负责人王福生,100039,北京市丰台路26号,中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室.fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332传真:010-63831870收稿日期2002-08-15接受日期2002-09-03 摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâArray）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（bioMarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生.蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志2002;10(12):1431-1435 0引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6].因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14].正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15].为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16].近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâArray的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhancedlaserdesorption/inionation-timeofflight-massspectra，SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18].本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述. 1ProteinChipâArray系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1蛋白质芯片系统的组成和原理蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19].根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energyabsorbingmolelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析.在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focusedlaserbeam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Balletal[20]采用一种称为人工神经网络（artificalneuralnetwork,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13454、13457和14278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1%.1.2ProteinChipâArray芯片和SELDI-TOF-MS的特点新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assistedlaserdesorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40];由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24].与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200Da-500KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25].对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26].而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强.因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27].(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28];(4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15].其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24].另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持. 2蛋白质芯片在基础研究方面的应用Thulasiramanetal,比较鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)的两种生理状态下的蛋白质全貌.鼠疫耶尔森菌有两个中间宿主中：一种为虱类，另一种为噬齿类.鼠疫耶尔森菌可以在两种温度下26℃和37℃表达不同的蛋白质，通过比较两种生理状态细胞溶解物，利用静态金属吸附捕获，强化阳离子交换芯片（SAX-2），鉴定出在37℃温度下存在而26℃生理状态下所没有的分子量为14.9KDa和78.8KDa的两个蛋白质.14.9KDa的蛋白质被鉴定为抗原-4，78.8Kda的蛋白质为Catalase/peroxidaseKatY蛋白质[29].Collinsetal[30]在体外,用SELDI-TOF证实结核杆菌中上WhiB3编码蛋白和Rpor编码蛋白相互作用.他们将WhiB3(his)和带有369-528氨基酸片段的RpoV基因，在大肠杆菌中过表达纯化.然后，分别用疏水表面H4芯片和IMAC-3静态金属离子的芯片与其结合.由于WhiB带有组氨酸作用位点，因而可以与带Ni2+离子的IMAC-3强烈结合，而不与H4芯片结合.带有396-528氨基酸的GST-RporV则与H4芯片结合.通过反相色谱化结合对照组表明GST-RporV与IMAC-3结合不具有显著性意义.然后把WhiB3固定在IMAC芯片上，分别用纯化的GST-RpoV、GST和伴清蛋白与WhiB3(his)作用.在质谱图中发现有GST-RpoV，从而证实WhiB3与RpoV之间有相互作用.ADIlakshmi最近报道，用ProteinChipâarray系统，通过生物素标记的全长度的S25mRNA作为芯片探针，来证实SELDI-TOF-MS鉴定出在肝瘤细胞处于氨基酸饥饿状态调节核糖体S25mRNA的两种新蛋白质.在对照组中，则不见表达.已往的实验证实，肝瘤细胞处于饥饿状态时，则p53蛋白与S25mRNA结合，在持续饥饿状态下，S25mRNA则从核内运输到胞质中，从而诱导细胞调亡.鉴定出的两个蛋白质分别La（RNA-bindingphosproproteinantigen,RNA结合磷蛋白抗原）43537Da和MTF-1（zincfingermetalresponseelement-bindingtrarscriptionfactor,锌指金属反应成分结合转录因子）72830Da.MTF-1还未见报道，其作用机制还需进一步研究[31,32].Amaar与其同事发现29KDa的胰岛素样生长因子结合蛋白质-5(Insulin-likegrowbindingprotein,IGFBP)，是一个重要的骨成形调节因子，其本身也是一种不依赖胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)的生长因子.而IGFBP-5有一段核内定位序列，因而推测他可能可以进入核内，并与核蛋白结合从而影响骨成形基因的转录.用IGFBP-5作为诱饵蛋白通过酵母双杂交观测与U2人骨肉瘤CDNA文库反应.结果发现与FHL2有相互作用，FHL2含有4个半LIM结构域.把FHL2固定在蛋白质芯片上，加上IGFBP3-6四个蛋白和对照组作用一段时间后，用缓冲液洗去.通过SELDI-TOF-MS分析,发现只有IGFBP-5组中出现一个质量28732.6+H的峰，而其他组则没有出现.证实IGFBP-5确实和FHL2作用从而调节骨的形成[33].3蛋白质芯片在临床方面的应用Christopheetal最近用含有铜离子的IMAC-3芯片鉴定出一个约16570Da的蛋白质.该蛋白质在胰腺癌患者的胰液中检出率为67%，在其他类胰脏病中的检出率为17%.用ProteinChip免疫鉴定该蛋白质是从急性胰腺炎和肝细胞癌患者的胰泡中释放出的一种称为HIP/PAP-I（hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associated-proteinI）的蛋白质.HIP/PAP-I水平在胰腺癌患者的胰液和血清中含量与对照组相比，二者都具有极显著性意义.但是，胰腺癌患者胰液中的HIP/PAP-I水平比血清中的大1000倍，与对照组相比，胰液中HIP/PAP-I的含量［患者组(143.75±235.52)mg/ml,对照组(6.04±7.59)mg/ml］远大于血清中的含量［患者组(99.96±140.66)ng/ml,对照组(35.25±28.44)ng/ml］.由此，可以根据患者胰液中HIP/PAP-I的含量来帮助鉴定是否患上致死率很高的胰腺癌[34].Wrightetal通过研究前列腺患者的组织提取液，寻找已知的前列腺特异抗原（PSA），前列腺酸性磷酸酶(prostaticacidphosphotase)，前列腺特异膜抗原（PMSA）和前列腺特异肽.所使用的方法：从使用LCM(lasercapturemicrodissection)方法获得的前列腺患者的细胞和体液中,发现了前列腺癌中上调两个分别为33KDa和18KDa的蛋白质[35-49].尽管没有发现单一蛋白质来区别前列腺癌患者和对照组,但却发现一组蛋白质的峰值与健康老年男性群体不同.而有报道发现一个50.8KDa的蛋白质存在于所检查的全部患者的血清和尿液中.这可能是50.8KDa蛋白质是由33KDa和18KDa的两个亚基构成的蛋白质,或者是两个单独的蛋白质由于芯片上的探针同时捕获了这两个蛋白质，这还需要进一步研究证实[29,35].有人发现了在乳腺癌细胞中存在28.3KDa特异蛋白质，由此设计出NMP66试剂盒，用其对可疑患者进行检测，结果在乳腺癌早期诊断中及晚期转移性乳腺癌的诊断上特异性达到100%,在排除非恶性肿瘤个体的特异性达到96%，远高于当前临床上目前应用的检测手段[50-52].Brown把SELDI-TOF和LCM技术相结合在3种卵巢肿瘤组织中发现一组特异肽段[53,54].Paweletzetal利用LCM获得细胞群，希望得到既有疾病特异性而且有组织特异性的诊断指纹图谱.他们分别比较了四组患者的乳腺、卵巢、食管和前列腺中的癌变上皮细胞.每1例抽取1500个细胞，用相同的芯片分析，结果在8例标本中均出现了同一质量的峰值，相同器官比较也都出现了相似的一系列峰值，证实了他们的猜想.这些峰与正常人的相应标本比较，可以对特定组织的特定部位是否癌变做出早期检测[54-57].Vlahouetal用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片分析一组患者的尿液中的蛋白质，发现肿瘤患者的尿液中有多种蛋白质的改变，其中包括5种异常的新蛋白和7种异常的蛋白组合，分子量从3.3-13.3KDa不等，从而把检测早期膀胱癌的准确率提高78%.以前的泌尿细胞学法检查准确率只有33%[58,59].在艾滋病的研究中，尽管早就知道CD8T细胞可以产生一种小分子蛋白，能在试管中抑制HIV感染，甚至可能在体内也有作用.但是这种抗病毒因子(CD8antiviralfactor，CAF)一直没有得到鉴定.美国Zhangetal应用SELDI发现了抗病毒因子CAF（CD8+antiviralfactor）,证实了CAF具有的强烈的抗HIV能力.他们的研究结果将在最近发表（个人交流）.应用蛋白质芯片技术对患者的组织和脑脊液进行检测，发现了一种含有39-43个氨基酸b-淀粉状肽段，目前是公认的人脑产生神经系统退行性改变的标志物，可导致基因突变毒害神经细胞. 4蛋白质谱分析技术在肝病研究中的应用我国是世界上的肝炎大国:1.3亿乙肝病毒携带者;2300万慢性肝炎患者；每年死于肝炎约23万人；每年防治费逾500亿人民币.迄今，尚无彻底根治乙型肝炎的治疗方案，因此慢性病毒性肝炎及其引起的肝硬化、肝癌等一系列肝病极大危害我国人民健康.目前有关的研究显示乙型肝炎的发病和机体免疫应答功能以及宿主遗传基因的多态性特点有直接的关系.在乙型肝炎病毒感染和致病的过程中，病毒和人体基因表达蛋白质谱及其在发病过程中的变化仍然是一个新的领域，蛋白质谱分析技术为我们系统地开展肝病蛋白组学的研究建立了一个良好的技术平台.以前发现在肝癌中有一特异蛋白（甲胎蛋白）与肝癌有关，而哪些蛋白质的变化可以直接反映人体急性、慢性乙型肝炎（轻型、中型和重型）、肝硬化和肝癌等病情，是本领域中最为关键的问题.现在，我们可以利用这一平台，比较这些患者蛋白质谱的特点，特别是阐明在不同发病阶段中，相关蛋白质谱的变化规律，这样能够全面展示各个病情阶段的蛋白质变化的全貌[4].例如，我们可以设计不同芯片组，把正常人肝组织抽提物，与慢性肝炎患者（HBV、HCV……阳性者等），特定急性自愈性肝炎患者、肝硬化以及肝癌患者的肝细胞抽提物，通过全面系统的进行SELDI-TOF-MS分析比较他们的蛋白质全貌，找出他们各自的单个或一组特异的生物标记，进一步分析他们的功能以及发现与之相关的新基因，对于了解疾病的进展和发病机制，非常有意义.此外，我们通过分析和监视相应蛋白质的变化、作用，能够及时掌握患者病程的特点和进展的趋势，这不仅有利于病情的诊断、而且对于患者的个体化治疗均具有重要价值.最终通过我们系统的研究，还可以发现药物作用的靶点，甚至直接依据蛋白质的特点设计新型药物.总之,蛋白质芯片系统是当前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台.由于该技术完全不依赖蛋白质的构象，从而优于那些类似DNA阵列的多属于抗体、抗原作用的普通蛋白质芯片，因为他们需要设计与重组蛋白质结合的技术.蛋白质芯片系统在研究超微量的蛋白质、高通量筛选蛋白质和鉴定生物标记等方面更加特异、快速、自动化.一旦某种疾病的单个或者一组生物标记被鉴定出来，就可以直接用于临床检测[12,15].Ciphergen公司推出的基于SELDI-TOF-MS的蛋白质芯片是一种新的技术，正在不断发展，但其还有大量工作要做：(1)芯片表面物质的固定技术的发展还有很大的潜力.(2)对于质谱的分析，还需要设计新的算法和软件，以消除背景噪声（backgroundnoise）,简化后期分析质谱中成千上万质峰的巨大工作量.(3)在蛋白质的序列、构象、提纯、特性无法给出描述，还需要和其他技术，如二维电泳、酵母双杂交、生物信息学等结合使用,才能给出蛋白质的生化特征.毫无疑问，这项技术在功能基因组时代将发挥巨大的作用.致谢我室刘明旭副研究员刚从美国回国，提供了有关本领域中研究资料，并对论文的修改提出了许多宝贵意见；美国Ciphergen公司中国部负责人许洋博士惠赠部分文献，在此一并表示衷心感谢. 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