用BVboost系统制备重组杆状病毒

材料

试剂

Bacto琼脂

Bluo-gal/X-gal(可选择）

Boost溶液1

10mmol/LTris-HCl(pH8.0)

10mmol/LEDTA

l〇〇/xg/6mlRNaseA

过滤除菌，4°C储存。

Boost溶液2

0•2mol/LNaOH

1%(m/V)SDS

过滤除菌，室温储存。

Boost溶液3(3mol/LKCH3COO,pH5.5)

高温高压灭菌，室温储存。

细胞系

大肠杆菌DH10BacATn7,用于电转的感受态细胞。

昆虫细胞S/9(ATCCCRL-1711)

Cellfectin(Invitrogen)

供体质粒（pBVboost或其任意衍生物；图2)

乙醇（70%)

庆大霉素

无菌水

昆虫细胞生长培养液，无血清（例如，InsectXpress[Biowhittaker]或Sf-900IISFM[Invitrogen])。

异丙醇

IPTG(可选择）

LB培养液

IOgbacto-胰蛋白胨

5gbacto-酵母提取物

IOgNaCl

加水至1L，用lmol/LNaOH调pH至7.5。

S.0.C.培养基

2gbacto胰蛋白胨

0•5gbacto酵母提取物

Imllmol/LNaCl

0.25mllmol/LKCl

Iml2mol/LMg储存液（lmol/LMgSO4,lmol/LMgCl2)

加水至1L

蔗糖

TE缓冲液（pH8.0)

四环素

lOmmol/LTris-HCl

lmmol/LEDTA

仪器

用于大肠杆菌和昆虫细胞培养的培养箱

离心机

电转仪和电转杯

用于细胞培养塑料器皿和移液器

无菌试管

方法
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大肠杆菌中杆状病毒基因组的转座

1.准备LB琼脂平板

a.将7.5g的baco-琼脂加入到l〇〇ml5XLB培养液中溶解，加水至500ml。

b•高温高压灭菌。

c.在水浴中将温度平衡至53°C。

d.加10%的蔗糖、lOug/ml四环素和7ug/ml庆大霉素。

如果要通过颜色来筛选转座，加lOOug/mlBluc-gal或60ug/mlX-gal和l〇〇mmol/LIPTG(步骤9和11)。

e.倒平板。

100mlLB-琼脂足以倒15个平板。

2•将可用于电转的DH10BacATn7大肠杆菌置于冰上，将冰浴的大肠杆菌等分并移至预冷的EP管，每份40ul。

3.5ulTE中加入Ing供体质粒，然后再加入大肠杆菌中，轻轻混勻。

4•将混合液转到预冷的电转杯中。根据设备说明进行电转。

5•加人Iml室温的S.0.C.培养液到混合物中。

6.将菌液转到2mlEP管，37°C，250r/min振荡培养4h。

7.用S.O.C.培养液连续稀释菌液至i〇^-1、10^-2、10^-3。

8•将未稀释的和连续稀释的样品各取1〇〇ul到Lb琼脂板上，涂布均匀。

9.将平板置于37°C孵育24h。
板上的克隆带有重组杆状病毒基因组。转座可以通过含有Bluo/X-gal和EPTG的平板，并将孵育时间延长至48h，最后通过颜色筛选来确定。

重组杆粒（杆状病毒基因组）DNA的分离

10.挑选克隆（接步骤9)。在一个装有5mlLB培养液的50mlNunc管中，加入lOug/ml四环素和7ug/ml庆大霉素和挑选的克隆。

11.37°C，250r/min振荡培养16h。

为了确定挑选适合的克隆，将克隆均匀涂布在含有Bluo——gal和IPTG的LBas-琼脂平板上，37°C培养过夜。

12.将Iml培养物移至新的I.5ml管中，14OOOg离心lmin。

13.弃上清，用300^1Boost溶液1轻轻的反复吹打以重悬细胞。

14.加入3〇0MlBoost溶液2,颠倒数次混匀，室温放置5min。

15•缓慢加人SOOfjJB00st溶液3,边加边轻轻混勻，冰上放置5min。

大肠杆菌基因组DNA和蛋白质的白色沉淀会在此步形成。

16.14OOOg离心l〇min。

17•在新的2ml管中加人〇.8ml无水异丙醇。

18.将上清小心移入到有异丙醇的管子中，要避免取到白色沉淀。颠倒管子数次混勻冰上放置5min。

19.4°C*14OOO公离心15min。

20.弃上清，每管中加人lml70%乙醇，颠倒管子数次，以清洗沉淀。

21.16℃，M000』H5min。

22.弃上清，晾干沉淀。

23.40ulTE溶液溶解DNA,轻轻振荡使其溶解。
沉淀可以置于冰箱中溶解过夜。如果不直接用于转染，杆粒DNA于一20-C保存，避免反复冻融。

重组杆粒DNA转染昆虫细胞以生产病毒

24.在6孔培养板的每一个35mm孔中接种I.5X10⁶Sf9细胞，每孔中加人2ml无血清昆虫细胞培养液。

使用成活率大于97%处于对数生长期的细胞（IXlO⁶〜2X10⁶个)。

25.28°C培养细胞Ih,使其贴壁。

26.转染试剂的准备

a.用昆虫细胞培养液稀释5ul杆粒（步骤23),终体积为l〇〇ul。

b•用昆虫细胞培养液稀释6u1Cellfectin转染试剂，终体积为IOOml

c•混合杆粒DNA和Cellfectin,轻轻混匀，室温孵育20〜45min。

d.加入0.8ml昆虫细胞培养液到装有脂质体-DNA复合物的管子中，轻轻混匀。

27•吸去培养板中的培养液，用Iml脂质体-DNA复合物,z孔覆盖细胞，28°C培养5h。

28•吸去转染试剂，加人2ml/孔昆虫细胞培养液。28°G培养3〜4d。

29•将培养上清转到一个无菌有盖的管子中。500g离心5min沉淀细胞碎片。将有病毒的上清转移到新的管中。

原代储备病毒在避光条件下可以在4°C存放6个月以上，在一70°c则可以存放更长的时间。

为了获得病毒最长的保存时间，可以在原代储备病毒中加人终浓度为2%的胎牛血清。

30•用噬斑形成法或终点稀释法来测定病毒滴度

二代储备病毒的产生

31•用moi为〇•01〜〇•1的原代储备病毒感染悬浮培养的Sf9细胞（1:名106个/ml，对数生长期）。

在这一步中使用低moi的病毒去避免有缺陷的干扰颗粒的积累是很重要的。通常的，60ul原代病毒储备液可以制备3〇ml的二代储备病毒。

32.28°C培养细胞4d。

33.IOOOg离心5min,将上清转移到一个新的管子中，4°C避光保存。

34•确定二代储备病毒的滴度。

乐观的估计二代储备病毒的滴度≥1〇⁸pfu/ml。

大规模的病毒和蛋白质的生产

35.用moi为〇.〇1〜〇•1(步骤36)或5.0(步骤37)的二代储备病毒感染所需体积的昆虫细胞（IX1o⁶个./ml)。28°C培养细胞3〜4d。下接步骤36或37。

36.制备用作转基因实验的病毒。

a.培养物5000g■离心20min。

b.将含有病毒的上清移到一无菌管中。浓缩病毒（AirenneetaL2000;Haeseleeretal.2001)。

c•测定病毒滴度。

37.重组蛋白质的生产。

a.IOOOg离心细胞20min。

b.从培养液或细胞中纯化表达的重组蛋白质，需要根据重组蛋白质的性质来加以确定。
在重组蛋白质上加入合适的亲和标签可以大大简化纯化的工作（AmauetaL2006)。